胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化

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摘要：摘 要：為研究胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化，以热引1号胡椒外种皮经培养获得的非胚性愈伤组织(Y)、胚性愈伤组织(P)、胚性愈伤组织与体细胞胚混合物(H)、体细胞胚(T)与体细胞胚增殖(Z)5个时期样品为试验材料，采用LC-MS/MS技术检测不同时期胚性培养物

　　摘 要：為研究胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化，以‘热引1号胡椒外种皮经培养获得的非胚性愈伤组织(Y)、胚性愈伤组织(P)、胚性愈伤组织与体细胞胚混合物(H)、体细胞胚(T)与体细胞胚增殖(Z)5个时期样品为试验材料，采用LC-MS/MS技术检测不同时期胚性培养物的内源激素种类与含量，以期找出内源激素影响胡椒体细胞胚发生的关键因素。结果表明：在胡椒体细胞胚发生过程中，吲哚-3-乙酸(IAA)含量在H时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期逐渐降低。吲哚-3-丁酸(IBA)含量在Y时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期基本不变。吲哚-3-甲酸(ICA)含量在H时期最高，且只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。异戊烯腺嘌呤(IP)含量在H时期最高，在P时期最低，在T与Z时期接近于零。顺式玉米素(cZ)含量在Y时期最高，其他时期都接近于零。茉莉酸甲酯(ME-JA)含量只存在Y时期和P时期，但Y时期含量高于P时期。茉莉酸(JA)含量在Z时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期逐渐升高。水杨酸(SA)含量在H时期最高，在Y时期最低，且H、T与Z时期先降后升。脱落酸(ABA)含量在H时期最高，在P时期最低，在T与Z时期基本不变。赤霉素类(GAS)主要存在于Y与P时期，H、T与Z时期含量很低。由此可见，IAA、SA与ABA可能与体细胞胚发生的相关性强，而cZ、MEJA与GAS可能与愈伤组织产生相关性强。

　　关键词：胡椒;愈伤组织;体细胞胚;内源激素

　　胡椒(Piper nigrum L.)为多年生热带攀援藤本植物，果实具有辛辣香气，是世界最重要的香辛料作物，也是人们喜爱的调味品[1-2]。目前，我国以‘热引1号胡椒为主栽品种，种苗来源一直以主蔓插条培育为主[3-4]。此法具有能够稳定保持种苗优良性状、后代发病率低等优点，但对其母株选择、苗圃规划、种苗培育环境与日常管理有较高要求，并且易受天气和人为因素的影响，成本高、周期长，无法满足产业发展对于大量优质种苗的需求。植物组织培养技术是一种无性繁殖方式，通过体细胞胚发生进行植株再生，能够极大地保留品种的优良性状和提高种苗的繁育效率，因此，組织培养技术对于胡椒种苗繁育具有重要的实用价值。

　　植物激素在调控细胞分化和生长方面具有重要作用，并在体细胞胚发生与发育方面起着调节作用[5]。目前，针对植物体细胞胚发生过程中内源激素研究主要集中于龙眼[6]、荔枝[7]与橡胶[8]等热带经济作物。然而，不同植物品种的不同部位体细胞胚发生所需最佳培养条件各有不同，内源激素种类与浓度是影响体细胞胚发生的重要因素。本研究拟以‘热引1号胡椒为研究对象，在胡椒体细胞胚发生过程中的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、愈伤组织与体细胞胚混合物、体细胞胚与体细胞胚增殖5个时期，研究不同时期胚性培养物的内源激素种类和含量及与体细胞胚发生的关系，以期为进一步完善胡椒体细胞胚发生提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　挑取‘热引1号胡椒外种皮，在MS培养基上25 ℃下暗培养60 d，获得非胚性愈伤组织及培养相同时间获得的胚性愈伤组织(图1)。A为胡椒外种皮，试验材料胡椒5个时期样品分别标记如下：B为非胚性愈伤组织(Y);C为胚性愈伤组织(P);D为胚性愈伤组织与体细胞胚混合物(H);E为体细胞胚(T);F为体细胞胚增殖(Z)。对P光培养40 d，对H进行取样;继续对P光培养90 d，再次挑取完全的T;继续对T光培养30 d，再次进行取样。每次取样后，立即对样品用液氮速冻后进行?80 ℃的低温保存。实验重复3次。

　　1.2 方法

　　1.2.1 激素标准曲线的制作 参照Malgorzata等[9]的方法，称取激素标准品，用甲醇(色谱纯)充分溶解后，取该溶液稀释后配制成母液，再进行等度稀释，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线。

　　1.2.2 粗提液的制备 参照?imura等[10]的方法，称取材料50 mg，重复3次，加入1 mL的激素提取剂进行研磨，取上清液，重复提取3次，进行冷冻高压冻干后，加入1 mL甲醇(色谱纯)重新溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，低温保存，备用。

　　1.2.3 LC-MS/MS检测条件 (1)色谱条件。参照Floková等[11]的方法，色谱柱为Waters色谱柱(Acquity Uplc Hss T3 C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm)。流动相：超纯水与乙腈(色谱纯)的体积比按时间进行梯度洗脱，流速0.35 mL/min，时间0～8 min、8～9 min、9～12 min的水∶乙腈流动相体积比分别为95∶5、5∶95、95∶5。

　　(2)质谱条件。参照Cui等[12]与Xiao等[13]的方法，利用标准品确定激素标准品的母离子与子离子最佳响应条件，并记录最佳锥孔电压和碰撞电压。每个离子对根据优化的去簇电压(declustering potential， DP)和碰撞能(collision energy， CE)进行扫描检测(表1，图2)。样本中激素的含量采用以下公式计算：

　　样本中激素含量(ng/g)=BCD/1000。

　　式中，B为样本中激素积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值(ng/mL);C为复溶时所用溶液的体积(μL);D为称取的样本质量(g)。

　　1.3 数据处理

　　用Analyst 1.6.1软件处理液相LC-MS/MS联用分析得到的质谱图数据，将检测到的所有样本激素的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，并代入计算公式，最终得到实际样本中

　　激素的绝对含量数据，并采用IBM SPSS Statistics 25.0与GraphPad Prism 8.0软件对数据进行ANOVA及相关性分析，生成图表并分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同时期胡椒体细胞胚生长素类(Auxin)含量变化

　　如图3所示，在对不同发育时期吲哚-3-乙酸(IAA)进行测定发现，IAA含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IAA含量最低为0 ng/g。不过，在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IAA含量都显著高于不分化的Y时期，但在体细胞胚发生过程中，IAA含量逐渐降低。

　　在对不同发育时期吲哚-3-丁酸(IBA)进行测定发现，IBA含量在Y时期最高达1.15 ng/g，在P时期IBA含量最低为0.08 ng/g。在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IBA含量基本不变，但三者的IBA含量都显著低于Y时期。

　　在对不同发育时期吲哚-3-甲酸(ICA)进行测定发现，ICA含量在H时期最高达1.58 ng/g，在T和Z时期ICA含量最低为0 ng/g。另外ICA只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。

　　在同一时期的生长素类激素比较中，Y时期中的IBA含量最高;在P时期中的ICA含量最高;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IAA含量最高。由相关结果分析可知，IAA可能与胡椒愈伤组织开始分化体细胞胚有关，而高含量的IBA可能与胡椒愈伤组织不分化有关。

　　不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

　　Different small letters represent extremely significant difference (P<0.05).

　　2.2 不同时期胡椒体细胞胚细胞分裂素类(CTK)含量变化

　　如图4所示，在对不同发育时期异戊烯腺嘌呤(IP)进行测定发现，IP含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IP含量最低为0.01 ng/g。在体细胞胚发生后的T与Z时期的IP含量降低到0.03 ng/g，显著低于不分化的Y时期。

　　在对不同发育时期顺式玉米素(cZ)进行测定发现，cZ含量在Y时期最高达1.33 ng/g，其他时期的cZ含量都较低，为0.01 ng/g左右。

　　在同一時期的细胞分裂素类激素比较中，Y时期中的cZ含量最高;在P时期中的IP与cZ含量都接近于零;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IP含量较高。由相关结果分析可知，cZ的存在可能与胡椒非胚性愈伤组织不分化有关，IP可能与胡椒体细胞胚发育有关。

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