辣椒枯萎病主要致病菌的分离鉴定及农用拮抗菌筛选

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摘要：摘要[目的]分离鉴定辣椒枯萎病主要致病菌，探寻能够有效抑制该致病菌的生防菌株。[方法]采用植物病害组织致病菌划线分离方法分离致病菌，经形态学以及ITS区域PCR检测，确定菌株属性，通过平板拮抗筛选，确定对该致病菌具有拮抗作用的农用生防菌株。[结果]初

　　摘要[目的]分离鉴定辣椒枯萎病主要致病菌，探寻能够有效抑制该致病菌的生防菌株。[方法]采用植物病害组织致病菌划线分离方法分离致病菌，经形态学以及ITS区域PCR检测，确定菌株属性，通过平板拮抗筛选，确定对该致病菌具有拮抗作用的农用生防菌株。[结果]初步鉴定该致病菌为尖孢镰刀(Fusariumoxysporum)，将该致病菌与11株农用微生物芽孢杆菌和3株农用微生物木霉菌进行拮抗试验，发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、海洋芽孢杆菌(Bacillusmarinus)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)6株芽孢杆菌对该致病菌拮抗效果明显，长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)与哈茨木霉(Trichodermaharzianum)2株木霉菌对该致病菌具有明显的拮抗效果。[结论]筛选到了8株能够有效抑制该病原菌的生防菌株，为以后研究生防肥料奠定了基础。

　　关键词枯萎病;分离;鉴定;拮抗菌;筛选

　　枯萎病作為一种常见的植物病害已成为制约经济作物发展的一大主要病害，特别是对黄瓜[1]、番茄[2]、茄子[3-4]、香蕉[5]以及款冬花[6]等造成了巨大经济损失，这些年随产业化集中，辣椒等蔬菜复种指数的提高，枯萎病的发生呈逐年增长趋势，严重影响了我国辣椒质量以及农户的收入，辣椒枯萎病的发生率一般为15%～30%，严重时达70%～80%，成为辣椒的一个重要病害[7]。研究表明，辣椒枯萎病主要为镰刀菌所致，黄立志等[8]、黄素芳等[9]、梁建根等[10]研究表明，广西玉林、福建漳州、山西等辣椒枯萎病均由尖孢镰刀菌所致。目前防治主要以化学手段为主，高残留耐药性等严重影响蔬菜品质[11]，引起环境污染和农药残留[12]。笔者从病原菌出发，分离病原菌探索对该病原菌具有拮抗作用的有益微生物，寻找对应的生物防治手段，从生物学角度提高辣椒品质，减少损失。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试材料取自安徽省蚌埠市五河县蔬菜基地，该基地蔬菜种类丰富，种植密度大，复耕率高，辣椒枯萎问题较为严重，在辣椒成株期间选取发病比较严重的地块，摘取样本。

　　基因组提取试剂盒购自上海生物工程有限公司，孟加拉红培养基购自北京奥博星生物科技有限责任公司，其成分：蛋白胨5.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，葡萄糖10g/L，氯霉素0.1g/L，孟加拉红0.033g/L，琼脂20g/L;马铃薯琼脂糖培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL，煮沸后保持20min，并用4层纱布过滤残渣，加入琼脂粉15g/L，pH自然;DNA扩增试剂盒购自上海生物工程有限公司。涉及到的芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、海洋芽孢杆菌(Bacillusmarinus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)、多黏芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)由山东土木启生物科技有限公司研发中心保存，生防真菌(绿色木霉(Trichodermaviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)由沈阳应用生态研究所提供。

　　1.2病原菌的分离纯化

　　选取发病植株的病根、茎部作为分离标本，分别用无菌水冲洗干净，并将组织切小块，在70%乙醇中浸泡30s，然后放入0.1%的升汞中浸泡5min，捞出后用无菌水冲洗10次以上，在无菌条件下接种于PDA平板上，接种时使得维管束一面与培养基正面接触，在28℃培养箱中培养3～5d，将长出菌落切取边缘部分重新接种到新的孟加拉红平板上培养，直到分离出单一形态的菌种，并将不同组织的分离菌落分别保存于4℃冰箱待用[6]。

　　将分离到的病原菌接种到PDA液体培养基中，在28℃、180r/min的条件下培养，分别以灌根和伤口接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌。并在孟加拉红、PDA培养基上分别观察菌落形态及菌丝孢囊形态，根据Booth[13]的方法进行初步鉴定。

　　1.3分子生物学鉴定

　　真菌基因组提取采用CTAB法[14]，通过PCR扩增菌株的ITS区域，测序后进行基因对比鉴定，引物F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，引物R：TCCTCCGCTTATTGATAT。

　　扩增程序：94℃預变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30循环，最后72℃延伸10min;扩增完成以后通过1%核酸凝胶电泳检测，并送北京擎科生物测序。将测序序列在NCBI中通过BLAST对比确定致病菌种类。

　　1.4农用拮抗菌筛选

　　将主要致病菌在PDA液体培养基中28℃、180r/min条件下培养3～5d形成均匀的悬浮菌液，吸取100μL菌悬液均匀涂布到PDA平板上，封口在30℃培养箱培养5～7d，选取长势良好的部位，铲取0.5m2大小的3块致病菌，均匀接种于马铃薯培养基上培养2～3d，取出后在培养基中心接种芽孢杆菌或者生防真菌，30℃培养3～5d观察拮抗情况并记录抑菌效果。

　　2结果与分析

　　2.1病原菌分离与纯化

　　通过对根部和茎基部病害区域的分离，共获得3株纯化菌株，在PDA斜面培养基上保存。将分离得到的纯化菌落同时以6×106个孢子数浇灌和茎基部切伤处涂抹的方式接种到室内盆栽培养的辣椒无菌苗上，发现只有1号致病呈萎蔫症状较明显，在幼苗根部出现病斑，初为浅黄褐色，后呈褐色，最后变成黑色，病株地上部出现萎蔫，最后叶片发黄、枯死，与田间辣椒枯萎病表现症状相同，初步确定1号为主要致病菌。

　　2.2病原菌形态

　　将1号菌株接种于PDA培养基上，菌丝为白色菌落边缘呈红色，羊毛状至毡状，菌落背面为紫红色;大型分生孢子形态为镰刀形，稍微弯曲，两端尖，无色，大部分单生无分割，个别有1～3个分隔，孢子大小为(67.5～164.7)μm×(364.7～811.7)μm(图1)，初步确定为尖孢镰刀菌。

　　2.3分子生物学鉴定结果

　　通过引物对ITS区域进行PCR扩增，发现在530bp处存在1条清晰的条带(图2)，经测序后通过基因数据库对比，发现其与尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)的相似度为99%，进一步佐证了形态学鉴定结果是正确的。

　　2.4农用拮抗微生物的筛选

　　共验证了14种常用生防菌与该病原菌的拮抗性，其中芽孢杆菌11株，有拮抗效果的8株，其中效果明显的有6株，分别为枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌;抑制效果一般的有2株，分别为胶冻样芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌;无抑菌效果的有3株，分别为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、高地芽孢杆菌(图3、表1);木霉菌3株，3株都存在抑菌效果，其中哈茨木霉抑菌效果最好，长枝木霉次之，绿色木霉只有竞争性抑制，效果不明显(图4、表1)。

　　3结论与讨论

　　通过分离鉴定发现引起辣椒枯萎病的病原菌主要为尖孢镰刀菌，并对该致病菌进行了初步拮抗试验筛选，发现哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌都对该株尖孢镰刀菌具有较好的抑制作用。其中哈茨木霉效果最佳，与此前研究发现哈茨木霉能够有效抑制番茄、黄瓜、西瓜枯萎病的结果相似[15-16]，曹君等[17]研究发现枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后共同作用对棉花枯萎病有较强的抑制作用，充分证实芽孢杆菌、木霉菌能够有效抑制植物病害的发生，在现有的发酵基础上有效地将芽孢杆菌和木霉菌进行复配，使其在作物根系周边建立有效的防御群体，阻断尖孢镰刀菌的侵染，同时还能够对作物生长起到一定的促进作用[18-20]，该结果将减少化学农药的使用，实现一个点对点的生物防治，为以后生物肥料、生物农药的开发提供科学依据，同时利用微生物菌来防治植物病虫害具有高效、经济、无副作用等优点。另一方面该研究中筛选出的致病菌又可以作为靶向病原菌用于筛选土壤有益微生物，进一步完善农用微生物体系。

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