药根碱靶向凝血因子Ⅻ发挥抗凝血作用的体外研究

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摘要：〔摘要〕 目的 以凝血因子Ⅻ (coagulation factor Ⅻ， FⅫ)為靶点探讨药根碱抗血栓作用的机制。方法 通过Ledock软件将药根碱分子与内源性凝血途径接触激活阶段关键靶蛋白FⅫ、活化凝血因子FⅫ (actived coagulation factor Ⅻ， FⅫa)、凝血因子Ⅺ (coagula

　　〔摘要〕 目的 以凝血因子Ⅻ (coagulation factor Ⅻ， FⅫ)為靶点探讨药根碱抗血栓作用的机制。方法 通过Ledock软件将药根碱分子与内源性凝血途径接触激活阶段关键靶蛋白FⅫ、活化凝血因子FⅫ (actived coagulation factor Ⅻ， FⅫa)、凝血因子Ⅺ (coagulation factor Ⅺ， FⅪ)和活化凝血因子Ⅺ (actived coagulation factor Ⅺ， FⅪa)进行分子对接，以结合能低于-5 kcal/mol作为阈值判断药根碱与接触激活因子的结合活性;采用体外凝血实验法检测血浆活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time， APTT)、血浆凝血酶原时间(plasma prothrombin time， PT)、凝血酶时间(plasma prothrombin time， TT);乏因子血浆纠正试验检测FⅫ、FⅪ、凝血因子Ⅸ (coagulation factor Ⅸ， FⅨ)、凝血因子Ⅷ (coagulation factor Ⅷ， FⅧ)、凝血因子Ⅹ (coagulation factor Ⅹ， FⅩ)和凝血因子Ⅶ (coagulation factor Ⅶ， FⅦ)的活性的抑制作用;Western blot法检测药根碱对FⅫ蛋白激活的抑制作用。结果 (1)分子对接实验表明，药根碱与FⅫa、FⅪa结合能均低于-5 kcal/mol，结合活性良好。(2)体外实验中，0.2～0.8 mg/mL药根碱均可显著延长APTT (P<0.01)，但不延长PT和TT (P>0.05)。(3)药根碱各剂量均显著降低FⅫ活性(P<0.01)，药根碱高剂量(0.8 mg/mL)可降低FⅪ活性(P<0.05)，但对FⅨ、FⅧ、FⅩ及FⅦ活性无显著影响(P>0.05)。(4)药根碱各剂量均显著抑制FⅫ蛋白的激活(P<0.01)。结论 药根碱与FⅫa对接较好，显著延长APTT，抑制FⅫ蛋白激活，降低血浆FⅫ活性，提示其抗栓作用可能通过抑制FⅫ的活性而发挥。

　　〔关键词〕 药根碱;内源性凝血途径;凝血因子Ⅻ;分子对接

　　血栓形成是严重威胁人类健康的一种病理过程。以血栓形成为基本病理特征的心脑血管疾病如中风、心肌梗死等，起病急、病情重、死亡率高，占非传染性疾病总死亡率的44%，已成为我国人口死亡与致残的首位原因[1]。目前，应用的抗血栓药可分为抗血小板药、抗凝血药和溶血栓药三大类[2]。随着人们对血栓形成机制的不断深入了解，以直接抑制凝血酶或抑制凝血因子Xa为作用靶点的抗栓药物也逐渐普及，但这些药物均干扰生理性止血过程，存在较严重的出血不良反应[3]。近年来研究发现，抑制内源性凝血途径的接触激活因子凝血因子Ⅻ (coagulation factor Ⅻ， FⅫ)、凝血因子Ⅺ (coagulation factor Ⅺ， FⅪ)、前激肽释放酶(prekallikrein， PK)或高分子激肽原(high molecular weight kininogen， HK)具有显著的抗血栓效果却无明显的出血不良反应[4-6]，提示内源性凝血途径的接触激活因子有望成为抗血栓药物的重要靶点。许多中草药和复方特别是活血化瘀类中药均能有效地防治血栓性疾病，主要是从抗血小板、抗凝血酶和促纤溶等方面发挥作用，确有疗效且安全的以接触激活因子为靶点的抗栓药物还不多。

　　药根碱(jatrorrhizine)是从毛茛科植物黄连、小檗科植物功劳木及防己科植物青牛胆等植物中提取出来的异喹啉类生物碱，其结构与小檗碱类似。药根碱及其衍生物具有抑制炎症、降血糖、降血脂、抗风湿、抗肿瘤等药理作用[7-9]，但其抗血栓作用的研究尚未涉及。本课题组以往研究发现，药根碱静脉注射可延长颈动脉血栓模型血管闭塞时间，减轻动脉血栓和静脉血栓模型的血栓重量，但不显著延长小鼠尾出血时间，提示药根碱具有确切的抗动脉血栓和静脉血栓形成的作用，出血不良反应轻，其作用机制可能是通过抑制凝血因子特别是内源性凝血途径的凝血因子活性而发挥作用[10]。为进一步研究药根碱抗血栓作用的机制，本研究从凝血因子活性探讨药根碱对凝血因子的抑制作用，明确其可能的作用靶点，为进一步揭示其作用机制提供科学依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验药物

　　药根碱(jatrorrhizine，CAS 3621-38-3，批号PRF908

　　0441)，质量分数≥95%，购自成都普法瑞科技开发有限公司。低分子肝素钠(达肝素，dalteparin sodium， CAS

　　9041-08-1，批号MB1914)购自大连美仑生物公司，每克抗因子Xa活性效价为133 000 U，使用时用生理盐水配制。玉米胰蛋白酶抑制剂(corn trypsin inhibitor，CTI，批号1018)购自美国Molecular Innovations公司。

　　1.2 动物

　　新西兰大白兔，雄性，体质量1.6～2.0 kg，动物许可证号：SCXK(湘)2015-0004，购自湖南太平生物科技有限公司。动物实验在湖南中医药大学实验动物中心完成，实验场地许可证号：SYXK(湘)2013-0005。动物的使用符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

　　1.3 主要试剂和仪器

　　高岭土(kaolin，批号93-1348)，购自美国Strem Chemicals公司。血浆活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time， APTT，批号253259)试剂、凝血酶原时间(prothrombin time， PT，批号253305)试剂、凝血酶时间(thrombin time， TT，批号252465)试剂、纤维蛋白原(fibrinogen， FIB，批号252569)试剂及质控品(批号12351，253868)、定标品(批号253180)、乏因子Ⅻ血浆(deficient Ⅻ plasma， 批号250883)、乏因子Ⅺ血浆(deficient Ⅺ plasma， 批号252200)、乏因子Ⅸ血浆(deficient Ⅸ plasma， 批号253639)、乏因子Ⅹ血浆(deficient Ⅹ plasma， 批号251434)、乏因子Ⅶ血浆 (deficient Ⅶ plasma， 批號252767)均购自法国斯塔高公司。乏因子Ⅷ血浆(deficient Ⅷ plasma， 批号547676)购自希森美康医用电子有限公司。FⅫ蛋白(factor Ⅻ protein，批号7690-250)购自美国Biovision公司。FⅫ抗体(anti-factor Ⅻ，批号ab242123)购自Abcam公司。HRP标记的羊抗兔二抗，批号AT0097，购自美国CMCTAG公司。TBST缓冲液(批号MA0091)、WB脱脂牛奶封闭液(批号MA0097)、飞克特超敏ECL液(批号MA0186)均购自大连美仑生物公司。

　　STA Compact Max 全自动凝血分析仪(法国斯塔高公司); CS-5100全自动凝血分析仪(希森美康医用电子有限公司)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 分子对接法评估药根碱与接触激活因子FⅫ、FⅪ的结合活性 从蛋白质数据库(protein data bank， PDB)中下载相应靶标蛋白的PDB文件：FⅫ对应的PDB_ID为4bdx，FⅫa对应的PDB_ID为4xe4，FⅪ对应的PDB_ID为5eok，FXIa对应的PDB_ID为4d76。选择靶标蛋白上的配体分子再通过pymol的GetBox Plugin计算对接盒子，再使用该对接盒子通过Ledock软件进行靶标受体蛋白去配体、离子、水等预处理后，导入FⅫ、FⅫa、FⅪ和FⅪa，并分别通过Ledock软件与药根碱分子进行对接，对接结果通过pymol进行可视化。评估药根碱分子和靶标蛋白的结合活性，以结合能低于-5 kcal/mol作为阈值[11]，结合能越低，则表明结合活性越好。

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