杜仲翅果皮酶解提取液的超滤工艺优化

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摘要：摘 要 目的：优化杜仲翅果皮酶解提取液的超滤工艺。方法：采用单因素实验考察超滤膜截留分子量、料液温度、操作压力、操作频率、过膜时间、料液浓度、料液pH对杜仲翅果皮酶解提取液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的转移率和固形物去除率的影响。固定超滤

　　摘 要 目的：优化杜仲翅果皮酶解提取液的超滤工艺。方法：采用单因素实验考察超滤膜截留分子量、料液温度、操作压力、操作频率、过膜时间、料液浓度、料液pH对杜仲翅果皮酶解提取液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的转移率和固形物去除率的影响。固定超滤膜截留分子量100 000、料液浓度7 g/L、料液pH 7，以料液温度、操作压力、操作频率、过膜时间为考察因素，以桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的转移率和固形物去除率的综合得分为评价指标，采用Box-Behnken设计-响应面法对超滤工艺进行优化并验证。结果：杜仲翅果皮酶解提取液的最佳超滤工艺为料液温度35 ℃、操作压力0.5 MPa、操作频率35 Hz、过膜时间42 min。验证试验结果显示，杜仲翅果皮酶解提取液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的转移率和固形物去除率的综合得分为78.06%(RSD=1.43%，n=3)，与预测值(77.18%)的相对误差为1.14%。结论：优化后的超滤工艺稳定、可靠，可用于杜仲翅果皮酶解提取液的超滤纯化。

　　关键词 杜仲翅果皮;超滤工艺;Box-Behnken设计;响应面法;桃叶珊瑚苷;京尼平苷酸;绿原酸

　　杜仲Eucommia ulmoides Oliv.属于被子植物门杜仲科Eucommiaceae，是我国重要的名贵中药材之一，传统以杜仲皮入药外，其叶、雄花、果实也具有很高的药用价值，在《神农本草经》《本草纲目》《中国药典》中均有详细记载[1-2]。杜仲翅果皮是杜仲果实的皮，其中含有环烯醚萜类、酚酸类、萜类、甾体类、苯丙素类等活性成分[3]。其中，苯丙素类化合物绿原酸具有抗菌、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗肥胖[6]、降血压[7-8]、神经保护[9]等药理作用，环烯醚萜类化合物桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸均具有保护神经、肝脏、心脏以及调节免疫、抗炎、抗肿瘤、降血糖等药理作用[10-14]。

　　本课题组前期采用酶解法、水提法、醇提法分别提取杜仲翅果皮中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸等成分，发现采用酶解法提取上述成分的效果最好。相关研究发现，中药提取液中除了有效成分外，通常还含有无机盐、鞣质、蛋白质、多糖、淀粉、果胶等无效成分[15-16]。本课题组在以酶解法提取杜仲翅果皮中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸等成分的过程中发现，该酶解提取液中同样含有上述无效成分，从而增加了该提取液的精制难度。

　　超滤膜法是基于选择透过原理的一种方法，可使相对分子质量小于超滤膜截留分子量的成分透过超滤膜，还可以截留90%以上的杂质(相对分子质量为1 000～ 300 000)，如有机物、胶体、悬浮固体等，从而可以实现有效成分(相对分子质量通常小于1 000)与杂质的分离，达到精制的目的[17]。该方法具有无相变、环保、高效、易实现自动化生产等特点，可保持有效成分的生物活性[17-18]。因此，本文课题组根据预实验结果，设计了杜仲翅果皮酶解提取液的超滤纯化工艺流程(见图1)。

　　基于此，本课题组采用酶解法制备杜仲翅果皮的酶解提取液，并根据设计的超滤纯化工艺流程，以其主要活性成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的转移率以及固形物去除率为指标，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken设计-响应面法优化该提取液的超滤工艺，以期为其精制方法优化提供参考。

　　1 材料

　　1.1 主要仪器

　　本研究所用主要仪器有：Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，SHA-C(A)型水浴恒温振荡器(绍兴市苏珀仪器有限公司)，DLSB-5L/10型低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，TG16.5型高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，A-10型超纯水仪(美国Millipore公司)，BSA124S-CW型电子天平(德国Sartorius公司)，HC-XS18-6X型高压型膜分离设备[包括聚醚砜卷式超滤膜UF1(截留分子量为10 000)、UF2(截留分子量为30 000)、UF3(截留分子量为100 000)]、HC-4015型澄清小试设备(成都和诚过滤技术有限公司)。

　　1.2 主要药品与试剂

　　本研究所用杜仲翅果皮购自山东贝隆杜仲生物工程有限公司，经贵州大学酿酒与食品工程学院张学俊教授鉴定为杜仲科植物杜仲E. ulmoides Oliv.的干燥翅果皮。其他药品与试剂有酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶(张家港大恒生物化工科技有限公司)，酸性木聚糖酶(潍坊苏科汉生物工程有限公司)，柠檬酸、柠檬酸钠(潍坊英轩实业有限公司)，桃叶珊瑚苷对照品、京尼平苷酸对照品、绿原酸对照品(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为SA9840、SG8110、SC8210，纯度均不低于98%);乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水。

　　2 方法与结果

　　2.1 杜仲翅果皮酶解提取液的制备

　　称取杜仲翅果皮50.0 g至1 000 mL三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 3.4)反复洗脱后的酸性蛋白酶液500 mL(酶含量为8%)，置于53 ℃恒温水浴中振荡8 h，再经过滤、抽滤后，得第1次滤液;将殘渣回收至三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 4.0)反复洗脱后的果胶酶液500 mL(酶含量为5%)，置于50 ℃恒温水浴中振荡8 h，再经过滤、抽滤后，得第2次滤液;再将残渣回收至三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.5)反复洗脱后的纤维素酶液500 mL(酶含量为5%)，置于55 ℃恒温水浴中振荡8 h，再经过滤、抽滤后，得第3次滤液;再次将残渣回收至三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 4.8)反复洗脱后的酸性木聚糖酶液500 mL(酶含量为6%)，置于45 ℃恒温水浴中振荡8 h，再经过滤、抽滤后，得第4次滤液;合并上述4次滤液，即得25 g/L(以生药量计)的杜仲翅果皮酶解提取液。

　　2.2 杜仲翅果皮酶解提取液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的含量测定

　　2.2.1 色谱条件 参考文献[19]的方法并进行优化后进行测定。色谱柱为WondaSil C18 Superb(4.6 mm×250 mm，5 μm);桃叶珊瑚苷的流动相为乙腈-水溶液(10 ∶ 90，V/V)，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，柱温为25 ℃，检测波长为204 nm;京尼平苷酸的流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液(16 ∶ 84，V/V)，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，柱温为35 ℃，检测波长为238 nm;绿原酸的流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液(24 ∶ 76，V/V)，流速为0.7 mL/min，进样量为15 μL，柱温为40 ℃，检测波长为330 nm。

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