香玲核桃组培的褐化观察

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摘要：摘要 通过组织培养香玲核桃，对不同时间中核桃苗的褐化现象进行观察，并提出了影响其褐化现象的一些因素。结果表明，初代培养采用改良DKW为基础培养基，添加1 g/L活性炭，核桃外植体用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。 关键词 核桃;组织培养;褐化;观察 推

　　摘要 通过组织培养香玲核桃，对不同时间中核桃苗的褐化现象进行观察，并提出了影响其褐化现象的一些因素。结果表明，初代培养采用改良DKW为基础培养基，添加1 g/L活性炭，核桃外植体用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。

　　关键词 核桃;组织培养;褐化;观察

　　推荐阅读：《山西农业大学学报》(自然科学版)创刊于1957年，是由山西农业大学主管、主办的学术性刊物。本刊坚持以马列主义、毛泽东思想、邓小平理论和三个代表重要思想为指导。

　　核桃是食疗佳果，含有大量脂肪和蛋白质极易被人体吸收，其中蛋白质中含有对人体极为重要的赖氨酸，对大脑神经的营养极为有益。核桃具有独特的滋补、营养、保健作用，常吃核桃不仅能滋养血脉，增进食欲，乌黑须发，而且还能医治性功能减退、神经衰弱、记忆衰退、肾结石及润肠通便等;对骨骼系统有益处，有防癌、防辐射作用，经常使用电脑者更视其为保健护肤的佳品;具有抗衰老作用，可以从多方面保护心血管系统，能预防心脑血管疾病。

　　褐变是由组织中的酚类物质经多酚氧化酶(PPO)氧化后产生棕褐色的醌类物质造成的[1]。外植体褐变是核桃苗褐变的主要方面，一般外植体褐变的发生受多因子影响。刘淑兰[2]在核桃组培试验中发现，培养基中无机盐含量和激素浓度、培养温度、外植体自身生理状态等都与褐变程度有关，较高培养温度(25±2)℃、培养基中较高无机盐浓度、较高激素浓度及木质化程度高的外植体都会促进褐化的发生。张小红等[3]以香玲核桃休眠芽和新生枝芽茎段作为试材进行褐化研究，发现嫩枝茎芽的褐化死亡率显著高于休眠芽和半木质化茎芽，不但褐化死亡率较低，而且腋芽萌发率显著高于休眠芽。

　　由此可见，不同芽位的外植体因木质化程度及其代谢活动存在着差异，在培养过程中褐化程度也不一样。此外，外植体的大小及伤害程度也是影响褐变发生的因素之一。另外，接种时各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐化。张建成等[4]研究认为，新改良的DKW培养基上的核桃试管芽苗较改良DKW培养基生长健壮，增殖率高;核桃试管芽苗继代增殖的最适pH为6.2;变温培养(光照期25℃±3℃，黑暗期18℃±2℃)较恒温培养(25℃±3℃)适于核桃试管芽苗的继代增殖。笔者通过组培观察了核桃苗褐变的过程，并提出了影响核桃苗褐变的一些因素。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　香玲核桃在甘肃成县核桃科技示范园采集。试验仪器有烧杯、天平、灭过菌的培养皿、剪刀、滤纸、酒精灯、计时器、纱布、托盘、锥形瓶、废液罐、一次性手套、玻璃棒、镊子、超净工作台(上海跃进医疗器械有限公司)、LDZX?鄄50KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。试验试剂有6?鄄BA、IBA、IAA、无菌水、酒精(75%)、升汞、注射用青霉素钠(哈药集团)、蔗糖(天津市永大化学试剂有限公司)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、琼脂粉、抗坏血酸(天津市大茂化学试剂厂)。

　　1.2 试验过程

　　试验用改良DKW作为诱导培养基，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，按表1培养基配制称取基本培养基、激素(6?鄄BA、IAA、IBA)、抗褐化剂(聚乙烯吡咯烷酮，PVP)、抗生素(青霉素)，待琼脂完全溶解后调pH为中性，用50 ml三角瓶进行分装;分别标记为H1、H5与H6，不同配方培养基分别制作30瓶，核桃茎段外植体先用自來水流水冲洗10～14 h，再分别用0.1%升汞消毒0.5、1、2 min后接入锥形瓶。

　　分别用不同的吸附剂VC、PVP、Na2S2O3、活性炭添加在DKW培养基中，用流水冲洗的核桃茎段作外植体，0.1%升汞消毒2 min，分别植入添加有VC、PVP、Na2S2O3、活性炭等吸附剂的锥形瓶中，每一吸附剂制作培养基30瓶。

　　按以上方法得到的锥形瓶，放于陇南师范高等专科学校农林技术学院植物组织培养室，培养条件为温度20～25℃，12 h光照。每天观察记录，统计褐化、污染及新芽的发生。

　　1.3 观察并记录

　　在核桃组织培养中，外植体的褐化现象较为普遍[4]，有不少学者采用添加不同剂量的活性炭管、Na2S2O3、VC、PVP等抑制褐化现象，取得较好的效果[5-7]。经过前期试验准备，确定每升培养基中添加2 g PVP和0.5 g VC。在12、72、144 h时观察并记录H1、H5、H6 培养基上核桃苗的褐化现象(图1～3)。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同消毒方式和培养基对核桃苗褐化的影响

　　从图1可以看出，核桃外植体的褐化在第1次观察(12 h)就有发生，随时间的推移，褐化现象会进一步加强，轻度是外植体底部与培养基接触面发生褐化，到后期整个外植体以及培养基均发生褐化(图2～3)。

　　用0.1%的升汞处理外植体，处理时间分别是0.5、1、2 min，发现不同的消毒方式H1、H5、H6 3种培养基上的表现不同，褐化率不同，其中H5培养基的褐化率较为稳定，保持在50%左右，H6培养基的褐化率较高，在升汞消毒0.5 min条件下，褐化率达到70%。H6培养基在升汞消毒2 min处理下，褐化率得到抑制，控制在30%以内，说明升汞的处理时间和褐化率有一定的相关性。

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