生物制造技术论文PCR-DGGE与Biolog技术的比较

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摘要：DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术，能直接分离土壤微生物的 DNA 片段，从分子水平上分析微生物的多样性。BIOLOG微平板分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法，评价不同样品微生物群落的结构组成。本文对 DGGE 和BIOLOG技术的原理及其

　　本篇生物制造技术论文对PCR-DGGE与Biolog技术进行了比较。DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术，能直接分离土壤微生物的 DNA 片段，从分子水平上分析微生物的多样性。BIOLOG微平板分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法，评价不同样品微生物群落的结构组成。本文对 DGGE 和BIOLOG技术的原理及其在土壤微生物多样性研究中的比较进行了介绍。

　　推荐期刊：《生物技术通报》(月刊)1985年创刊，中华人民共和国农业部主管，是由中国农业科学院科技文献信息中心、中国农业科学院生物技术研究中心、中国农学会高新技术委员会联合主办的生物技术综合性报道刊物。以综述、论文、译文、简报、简讯、动态及文摘等多种形式报道国内外生物技术研究的最新成果和进展。

　　关键词：土壤微生物;多样性;PCR-DGGE;Biolog;比较

　　土壤微生物是生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。土壤微生物积极参与土壤物质转化过程，在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构的形成与改良、有毒物质降解及净化等方面起着重要作用 [1]。因此土壤微生物指标已被公认为土壤生态系统变化的预警及敏感指标[2]。在分子生物学技术出现之前，对于微生物的了解多数是通过纯培养或观察形态。但是自然界中有85%- 99.9%的微生物至今还不可纯培养[3]，这给客观认识环境中的微生物存在状况造成了严重障碍。随着生物技术的不断地发展，更多的分子技术方法应用于土壤微生物多样性的研究中。本文主要介绍了PCR-DGGE 与BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的应用，以及各自的用缺点，为相关研究提供一些参考。

　　1　土壤微生物多样性

　　土壤微生物多样性指土壤微生物在遗传、种类和生态系统层次上的变化。包括微生物种类、数量、分布以及群落结构的变异性、相互作用的复杂性和功能多样性在内的生态多样性，反映了土壤生态机制和土壤胁迫对微生物群落总体的影响。微生物多样性的研究可以分为3个层次：物种多样性、遗传多样性、结构多样性以及功能多样性[4]。在土壤中存在的大部分细菌为G+细菌，并且G+细菌的数目要比淡水和海洋生境中的G+细菌数目高。放线菌占土壤细菌群体的 10%～33%。在土壤中还有许多化能异养菌能对无机物进行转化，这对于维持土壤肥力是必要的。在土壤中还存在一部分的真菌，土壤真菌可以以游离的状态存在或与植物根形成菌根关系。

　　2　PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用

　　变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术最早是由Fischer等人用于检测DNA突变的一种电泳技术[5]。基本原理：DNA分子在含有线性浓度梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，当DNA分子迁移到一定的变性剂浓度并且开始部分DNA片段的解链，DNA分子的空间构型就会发生改变，导致部分解链的DNA分子在凝胶中的迁移速率急剧下降。

　　变性梯度凝胶电泳由于其具有准确性高、重复性好、速度快等特点，被广泛应用于微生物的生态学研究。目前，DGGE电泳技术已经成为微生物群落多样性和动态分析的非常好的技术手段。首先，分析自然生态系统中土壤微生物的群落结构多样性，由于自然条件、土壤条件和其它一些环境因素的影响，土壤中的微生物群落也会有很大的差异[6]。DGGE电泳技术还应用于人为干扰对于土壤微生物群落结构的影响 [7]。

　　3　BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的应用

　　1991年，BIOLOG微平板分析法开始应用于土壤微生物多样性的研究[8]。BIOLOG 测试板含有96个小孔，除一个对照外，其余95孔内含有不同的有机碳源和一种指示剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性[9]。杨永华等应用BIOLOG技术研究农药污的土壤中的微生物群落结构，结果显示，土壤微生物的各方面指数都低于无污染的土壤微生物，说明在农药污染的土壤中微生物多样性下降，同时微生物的种类也在减少[10]。

　　4　PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的比较

　　PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法从不同生态层面上揭示了土壤微生物群落结构及多样性变化，但每一种研究方法都有自身的优点和局限性。

　　目前，PCR-DGGE技术在微生物的多样性研究中应用比较广泛。DGGE直接利用DNA及 RNA对微生物遗传特性进行表征，不但避免了传统上耗时的菌种分离，更可进而鉴定出无法利用传统方法分离出来的菌种。DGGE的优点：(1)无需进行微生物培养;(2)突变检出率高;(3)可将突变分子同野生型分子分开;(4)无须标记;(5)操作简便、快速、重复性好等。缺点：(1)只能分离较小的片段 (< 500 bp);(2)图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株;(3)DGGE通常显示群落中优势种类;(4)可能导致自然群落中细菌数量的过多估计;(5)若数据库中基因序列信息不够丰富，将会限制 DGGE的使用;(6)需要专门设备;(7)含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶;(8)无法确定突变在 DNA 片段中位置。

　　而BIOLOG微平板分析法是以群落水平碳源利用类型为基础研究土壤微生物群落功能多样性。能够快速的检测出土壤微生物的多样性，而且重复性较好，获得的数据变化较大。BIOLOG方法主要依赖于群体的生理活性，作为一种研究微生物群落功能多样性的方法仍然存在一些问题。比如 BIOLOG方法较适用于检测和鉴定土壤中快速生长型或富营养微生物类群的活性，不适用于反映土壤中生长缓慢或不能培养的微生物信息。土壤微生物在 BIOLOG板内生长时，由于湿度、渗透压和pH值等的变化，引起微生物对碳底物实际利用能力的改变。因此，BIOLOG反应的特征只能粗略地代表实际土壤微生物的多样性。

　　5　结语

　　随着人类对土壤生态系统的不断研究和探索土壤微生物在物质循环、能量流动和维持生态系统多样性与稳定性方面的重要性被人们广泛认可并展开深入研究，土壤微生物是一个丰富的微生物资源库，加强对土壤微生物多样性的理解，能对微生物资源进行合理的开发和利用。

　　PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的比较可以看出，BIOLOG得到的数据较PCR-DGGE技术得到的数据变化更大，而PCR-DGGE技术在检测群落组成和群落结构方面比BIOLOG方法更敏感，反映的信息更多，标准偏差更小。因此，为了获取较为全面的微生物多样性信息，应尽可能用多种研究方法将微生物群落在生长，生理和遗传信息等各个层次上的数据有机结合起来，并不断设计更简单、准确的研究方法，提供更加全面、准确的微生物变化信息。为微生物资源开发利用提供更有效的方法。

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