益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响

来源：核心期刊咨询网时间：12

摘要：〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖的效应。方法 采用实时无标记细胞功能分析技术(real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA)动态监测不同浓度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的益气解毒方水提物对人鼻咽癌CNE2细胞

　　〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖的效应。方法 采用实时无标记细胞功能分析技术(real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA)动态监测不同浓度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的益气解毒方水提物对人鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响;采用CCK-8法检测不同浓度益气解毒方水提物对人鼻咽癌CNE2细胞增殖能力的影响;通过高通量细胞成像多功能检测系统Cytation5监测不同浓度益气解毒方水提物对鼻咽癌CNE2细胞增殖形态的影响;采用Western Blot技术检测不同浓度益气解毒方水提物对鼻咽癌CNE2细胞增殖相关蛋白Survivin、XIAP、PCNA表达的影响。

　　《动物学杂志》(双月刊)创刊于1957年，是由中国科学院主管、中国动物学会和中国科学院动物研究所主办的综合性学术刊物。

　　结果 RTCA 和 CCK-8 法实验结果显示，与空白对照组比较，益气解毒方水提物可以明显抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖，而且随着益气解毒方水提物的作用时间越长，其抑制效应越显著(P<0.05);Cytation5结果显示，与空白对照组比较，不同浓度益气解毒方水提物处理CNE2细胞后，细胞形态发生了明显变化，且浓度越高，作用时间越长，细胞膜皱缩，细胞核质浓缩、破碎更明显;Western Blot结果显示，与空白对照组比较，益气解毒方水提物能明显抑制CNE2细胞中增殖相关蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表达(P<0.05)。结论 益气解毒方水提物能明显抑制鼻咽癌细胞增殖，该效应与其抑制增殖相关蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表达有关。

　　〔关键词〕 益气解毒方;鼻咽癌;细胞增殖;Survivin;XIAP;PCNA

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是目前比較常见的头颈部恶性肿瘤，在南方的发病几率比较高[1]，其发病与遗传因素、EB病毒感染、环境影响等关系密切[2-3]，目前公认鼻咽癌的有效治疗方法为放疗、化疗，但放化疗有其固有的局限性，如敏感性降低、放疗后的不良反应大、复发甚至转移等[4]，寻求一种更加安全高效的诊疗方式是耳鼻咽喉科医生在临床治疗中迫切需要解决的问题。

　　益气解毒方(以下简称YQ)是湖南中医药大学第一附属医院田道法教授依据临床经验创立的经验方，能够有效减轻放疗化疗所带来的副反应[5]。前期体内外实验研究表明，该方能够有效抑制人鼻咽癌不同分化类型细胞株，如5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HNE1等细胞的增殖、迁移，并具有诱导其凋亡的效应[6-10]。

　　本研究选取CNE2细胞株，从增殖、形态变化方面观察益气解毒方水提物对鼻咽癌CNE2细胞增殖效应的影响，通过实时无标记细胞功能分析技术(real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA)和CCK-8法检测益气解毒方水提物在不同时间点对CNE2细胞的抑制增殖效应，采用Cytation5动态监测益气解毒方水提物对CNE2细胞形态变化的影响，最后用Western Blot检测益气解毒方水提物对CNE2细胞增殖相关蛋白Survivin、XIAP、PCNA表达的影响，探讨益气解毒方抑制CNE2细胞增殖的作用机制，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株

　　人鼻咽癌细胞株CNE2，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代培养。

　　1.2 实验药物及试剂

　　益气解毒方药物组成及水提物的制备：黄芪30 g，党参15 g，黄连10 g，白花蛇舌草10 g，茯苓15 g，天花粉10 g，甘草6 g。煎煮收集药液浓缩，并冷冻干燥，干燥完全后将水提物-20 ℃密封保存，用培养基配成4.0 mg/mL的母液，主要参考廖雪等[11]的制备方法。RPMI-1640培养基、PBS缓冲液(Hyclone公司);胎牛血清(Gibco公司);DMSO(Amresco公司);CCK-8试剂盒(日本同仁公司);一抗Survivin、XIAP、PCNA(CellSignalingTechnology，CST公司)。

　　1.3 实验仪器

　　贺利氏HERAcell 150i CO2培养箱(赛默飞世尔公司);ELX800全自动酶标分析仪(BioTek公司);5415R高速冷冻离心机(Eppendorf公司);实时无标记细胞功能分析仪(艾森生物科技公司);Cytation5高通量细胞成像多功能检测系统(美国伯腾仪器有限公司);倒置显微镜(Olympus 公司);Odyssey CLX荧光扫描成像系统(Gene有限公司)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 细胞培养 将鼻咽癌CNE2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2、湿度饱和的恒温细胞培养箱内培养，细胞生长至70%～80%传代，取对数生长期细胞用于实验。

　　1.4.2 RTCA监测细胞增殖情况 取对数生长期CNE2细胞，消化重悬成单个细胞，调整浓度为每毫升5×104个细胞，接种到RTCA专用细胞增殖检测培养板，每个孔加入100 μL CNE2细胞悬液，等细胞指数(cell index， CI)达到1.0时，加入不同浓度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益气解毒方水提物(前期实验结果显示，此浓度范围药物对细胞无毒性)，同时设空白对照组(Control组)，每个组3个复孔，不同浓度组每孔加入药液200 μL，Control组每孔加入细胞培养液200 μL，采用RTCA动态监测，并用CI值表示CNE2细胞的增殖状况。

　　CI=(Rn-Rb)/15

　　Rn表示某个孔接种了细胞后的电极阻抗值，Rb表示某个孔中只有培养基时的背景阻抗值[12]。根据曲线分析水提物的药效随浓度及时间变化的特征，并用仪器自带的软件计算出合适时间点的半数抑制率浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50) 。

　　1.4.3 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期的CNE2细胞，按照每100 μL培养液中5×103个细胞种入96孔板，过夜，待CNE2细胞贴壁后，药物组每个孔分别加入不同浓度的200 μL含药培养液，Control组每孔加入细胞培养液200 μL，实验分组同“1.4.2”，每个组设置5个复孔，培养箱中培养一定时间。另外，设定只加细胞培养液、不加CNE2细胞的空白孔(用于A值校正)。药物作用24、48、72 h后，每个孔(包含空白孔)分别加100 μL现配的CCK-8溶液，继续培养2 h，实验重复3次。酶标仪检测450 nm波长的吸光度值(A值)，记录实验结果，计算出细胞的增殖率及各时间点的IC50值。

　　细胞增殖率=(A值实验组-A 值空白孔)/(A值Control组-A值空白孔)×100%

　　1.4.4 高通量细胞成像多功能检测系统Cytation5监测细胞形态变化 取对数生长期的CNE2细胞，消化重悬成单个细胞，96孔板铺板，按照5×103个细胞每个孔，加100 μL体积细胞悬液到每个孔，过夜，待CNE2细胞贴壁后，根据“1.4.2”结果，确定水提物处理CNE2细胞的浓度，药物组每个孔分别加入不同浓度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含药培养液200 μL，Control组每孔加入细胞培养液200 μL，采用Cytation5监测细胞生长形态，并设定6 h拍摄一次细胞形态图像，并记录实验结果。

转载请注明来自：http://www.qikan2017.com/lunwen/yix/14762.html