花楸成熟种胚组织培养方法研究

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摘要：材料与方法 1.材料 本试验中以花楸成熟种胚为外植体，种子采于黑龙江植物园的花楸成熟果实，调制后在4℃冰箱中贮存。将材料用自来水浸泡18h，然后用70%的酒精浸泡30s，再用2%的NaClO溶液搅拌消毒处理10min，然后在无菌工作台上用无菌水冲洗5～7次，再用解剖

　　材料与方法
　　1.材料
　　本试验中以花楸成熟种胚为外植体，种子采于黑龙江植物园的花楸成熟果实，调制后在4℃冰箱中贮存。将材料用自来水浸泡18h，然后用70%的酒精浸泡30s，再用2%的NaClO溶液搅拌消毒处理10min，然后在无菌工作台上用无菌水冲洗5～7次，再用解剖刀切破种皮子叶端，剥出成熟胚待接种之用。
　　2.方法
　　1)不定芽的诱导：把成熟胚接种在附加了不同浓度的6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）的MS和WPM固体培养基上。每组激素组合接种6瓶，每瓶接种5个种胚。观察不定芽生长状况，并在第20天开始统计不定芽诱导率。根据不定芽诱导率，选择最佳培养基与激素组合。2)不定芽的增殖：观察不定芽生长状况，当不定芽生长0.5cm时转接到附加了不同质量浓度的6-BA、IAA激素的MS增殖培养基上进行培养。3)不定芽的生根：将增殖到长度1.0～1.5cm的不定芽接种到附加了不同质量浓度的IBA或NAA的1/2MS培养基上，进行生根培养。4)培养条件：采用日光灯照射进行光照培养，光照16h，黑暗8h，光强2000～3000lx，温度(25±1)℃，湿度70%～80%。5)数据统计：通过统计不定芽和生根的数量，分别计算出不定芽诱导率和生根率。不定芽诱导率＝（诱导出不定芽外植体数/接种的外植体总数）×100%；生根率＝（生根不定芽数/接入不定芽总数）×100%。
　　结果与分析
　　1.不同处理对花楸种胚不定芽诱导的影响
　　1)不同基本培养基对花楸种胚不定芽诱导的影响：将接种在MS和WPM培养基上的花楸成熟种胚培养7d后，胚芽膨大，3周后部分成熟胚胚芽处出现不定芽。1个月后，不同培养基中花楸成熟胚不定芽诱导率出现差异，诱导不定芽3周后统计诱导情况。在MS培养基中，不定芽诱导率为80.33%；在WPM培养基中，不定芽诱导率为60.00%。经过X2分析得出，MS和WPM培养基上产生的不定芽诱导率之间有显著差异，即η＝4.02＞Xα＝3.84。结果指出MS培养基对不定芽的诱导效果优于WPM培养基。
　　2)不同激素质量浓度组合对花楸种胚不定芽诱导的影响：通过对激素质量浓度组合筛选，本试验中选择了不同质量浓度的6-BA、NAA组合研究其对不定芽诱导的影响。将花楸成熟种胚培养12d后，观察到生长很好的嫩绿不定芽，3周后部分不定芽长到1～2cm。1个月后，不同激素质量浓度组合处理中花楸成熟胚不定芽的诱导率出现差异。由表2可以看出，在附加NAA0.5mg/L和6-BA0.5mg/L的MS培养基中，不定芽诱导率最高达80.33%，经过X2分析得出，激素质量浓度组合5与组合1、3、4、6、7、9之间芽诱导率均有显著差异（X0.05=3.84），即η1-5=7.50＞X0.05、η3-5=6.20＞X0.05、η4-5=5.08＞X0.05、η5-6=6.20＞X0.05、η5-7=10.33＞X0.05、η5-9=5.08＞X0.05，而其它各组合之间的芽诱导率无显著差异。在附加NAA1.0mg/L和6-BA0.5mg/L的WPM培养基中，诱导率最高为60.00%，经过X2分析得出，激素质量浓度组合6与组合1、2、8、9，组合2与组合7之间芽诱导率均有显著差异，即η1-6=5.45＞X0.05、η2-6=4.29＞X0.05、η5-8=4.29＞X0.05、η5-9=6.78＞X0.05，而其它各组合之间芽诱导率无显著差异。
　　2.不同激素质量浓度组合对花楸种胚不定芽增殖的影响
　　经初代培养诱导不定芽，把不定芽转接到附加了不同质量浓度的6-BA、IAA的MS增殖培养基上进行培养，经过2周可进一步诱导增殖出5～13个不定芽，与初代培养诱导不定芽的情形相似。培养中，如激素6-BA质量浓度过高会出现玻璃化现象，在后期抑制根的生长。不同激素质量浓度组合对不定芽增殖的影响见表3。从表3可以看出，不定芽增殖的最佳激素组合和质量浓度为IAA0.5mg/L＋6-BA0.2mg/L。
　　3.不同质量浓度的激素对花楸种胚不定芽生根的影响
　　待不定芽高1.0～1.5cm时，从基部剪下，移至生根培养基中，5d后芽基部陆续出现白色突起或愈伤组织，10～15d后可见发达的白色、黄绿色或红色主根，1个月后大量须根产生，并形成发达的根系。激素IBA质量浓度对生根数量的影响如表4所示。在1/2MS培养基中，IBA质量浓度为0.2mg/L，根数量最大，不定根诱导率为70%，根长随着IBA质量浓度的逐渐增高而渐渐变短，当IBA质量浓度为0.2～0.3mg/L时，根长差别不大，然后根长逐渐变大，从根的生长状态来看，添加IBA的处理中根粗壮，须根多，移栽容易成活。激素NAA质量浓度对生根数量的影响如表4所示。在1/2MS培养基中，NAA质量浓度为0.3mg/L，生根数量最大，不定根诱导率为50%，随着NAA质量浓度的逐渐变大，根的数量先增多后减少，当NAA质量浓度为0.2～0.3mg/L时，根长差别不大，然后根长逐渐变大，须根多，移栽容易成活。经过X2分析得出，处理6与处理2、4、5、8，处理3与1之间的不定根诱导率有显著差异，即η6-2=η6-5=η6-8=5.05＞X0.05、η6-4=7.5＞X0.05、η3-1=6.67＞X0.05，而其它处理间不定根诱导率无显著差异。
　　结论与讨论
　　（1）愈伤组织和不定芽诱导：建立高频再生体系的基础和关键技术环节是愈伤组织和不定芽的诱导。高质量的诱导组织是进一步诱导分化和生根的前提和基础[7-8]。本研究中得出，诱导花楸成熟种胚产生不定芽的适宜培养基为MS＋6-BA0.5mg/L＋NAA0.5mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L，WPM＋6-BA0.5mg/L＋NAA1.0mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L，其成熟种胚不定芽诱导率分别为80.33%、60.00%。MS培养基的成熟种胚不定芽诱导率比WPM培养基的诱导率高，诱导出的愈伤组织和不定芽质量高，具有较大的繁殖潜力。诱导不定芽增殖的最适培养基为MS＋6-BA0.2mg/L＋IAA0.5mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L，可诱导增殖出5～13个不定芽。
　　（2）生根培养：通过生根培养中激素种类和浓度的对比试验得出，生根培养效果最好的培养基是1/2MS＋IBA0.2mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L，成熟种胚不定芽生根率为70%。当培养基是1/2MS＋NAA0.2mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L时，成熟种胚不定芽生根率为50%。在生根培养试验过程中发现，随着IBA或NAA质量浓度的增加，根变粗。可能是因为当IBA或NAA达到一定的质量浓度后会抑制根的伸长生长，刺激根的增粗生长，增加根系的吸收面积，这有利于移栽成活率的提高。但是当IBA或NAA的质量浓度高于0.3mg/L时，根出现肉质化，说明较高质量浓度的IBA或NAA对生根有毒害作用，影响生根质量，造成畸形根的形成，从而阻碍不定根的生长。所以IBA或NAA的质量浓度对于不定根的生长发育具有较大的影响。及时转瓶是诱导花楸生根培养过程中值得注意的问题。当培养出不定芽翠绿发亮、根粗壮、根须发达的植株时，必须及时转瓶到新鲜的培养基中培养，否则将影响植株的生长。一些研究指出，可能是因为外植体在初代培养的过程中，由于本身的生物学特性和培养条件的影响，机体会分泌一些有毒的物质，如果不及时转瓶，渗透到培养基中的有害物质会影响培养物的生长和分化；这种状况也可能是由于生长素在增殖培养基中残留作用的影响。其原因有待进一步深入研究。（本文图、表略）

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