不同浓度硒酸钠对茶树的生长和生理指标的影响

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摘要：摘要：該文以一年生扦插苗为材料，采用水培试验，研究不同浓度的硒酸钠(0、0.15、0.3、1.5、3、5、8 mgL1)对茶苗的硒积累、植株生长、生理指标和根尖显微结构等参数的影响。结果表明：茶苗的根和新梢中的硒含量与营养液中的硒浓度正相关;随着硒浓度升高，茶

　　摘要：該文以一年生扦插苗为材料，采用水培试验，研究不同浓度的硒酸钠(0、0.15、0.3、1.5、3、5、8 mg·L1)对茶苗的硒积累、植株生长、生理指标和根尖显微结构等参数的影响。结果表明：茶苗的根和新梢中的硒含量与营养液中的硒浓度正相关;随着硒浓度升高，茶苗的鲜重、侧根数量、根系生物量、光合色素含量、根系活力等生长指标，茶多酚、可溶性蛋白、可溶性糖等茶叶质量指标均呈现先升后降趋势;而丙二醛、过氧化氢、脯氨酸含量等抗逆生理指标则呈现先降后升趋势。显微结构分析显示在不同硒浓度处理条件下根尖的显微构造存在差异。低硒浓度(0.15、0.3、1.5 mg·L1)处理的茶苗根尖的皮层薄壁细胞饱满、完好，表皮细胞较小;高硒浓度(Se≥3 mg·L1)处理的茶苗根尖的皮层薄壁细胞变形或受损，表皮细胞增厚，表现出胁迫反应。上述结果说明硒对茶树具有双重效应，合适浓度(0.3 mg·L1)硒对茶树生长和茶叶品质有益，表现为光合作用和根系活力增强，过氧化物和脯氨酸含量降低，生物量增加，茶叶茶多酚含量增加;硒浓度过高(≥3 mg·L1)对茶苗的生长和茶叶品质有害，表现为茶苗出现胁迫反应，茶多酚降低。该研究结果为进一步研究硒对茶树的双重作用机制和富硒茶的栽培提供参考。

　　关键词： 富硒茶， 茶多酚， 根系活力， 显微结构， 双重效应

　　早期，硒(Selenium，Se)被认为是有毒元素，在它被发现的一百多年后硒的重要性才逐渐被人们认识(Schwarz & Foltz， 1957)。人体缺硒会提高克山病、大骨节病等疾病的发病率(Fleet， 2009;Loscalzo， 2014);合理摄入硒元素则有增强免疫力、延缓衰老、预防癌症、预防心血管疾病等有益作用(Rayman et al.， 2000)。中国卫计委建议正常成人每天摄入硒元素的范围为50～400 μg(中国卫生行业标准WS/T 578.32017)。硒是稀缺分散元素，硒资源贫瘠是世界性问题(Zhu et al.， 2009)。目前科学界还没有充分证据证明硒是高等植物所必需的(Lobanov et al.， 2007)。硒作为一种微量元素，在根际土壤中硒浓度过高时会对植物产生毒害作用。近年来，低浓度的硒对植物生长有益的证据日趋增多，如在水稻(Yin et al.， 2019)、玉米(Shanker et al.， 1996)、油菜(Ulhassan et al.， 2019)、芥菜(Naz et al.， 2015)、烟草(Jiang et al.， 2015)中的报道。

　　Hawrylaknowak et al.(2015)将硒元素对植物生长的毒害作用和有益作用称为双重效应。目前，硒对植物产生的双重效应机制尚未完全清晰，由于该机制的解析对富硒农作物的种植、人体健康、生态平衡有重要而长远的意义，因此该领域越来越受到科学界的关注。

　　茶叶是世界三大无醇饮料之一，消费群体庞大。近年来，越来越多的研究表明茶叶及茶多酚在减少肥胖、延缓衰老、防治心脑血管疾病和某些癌症等方面存在医疗保健价值(Shen et al.， 2011;Khan & Mukhtar， 2013;Henning et al.， 2015)。茶樹(Camellia sinensis)是一种富硒能力较强的作物(艾春月等，2019)，现行富硒茶的硒含量标准(0.25～4 mg·kg1，NY/T 6002002)比富硒稻米的硒含量高出许多(0.04～0.3 mg·kg1，GB/T 224992008)。

　　Molan et al.(2009)认为硒与茶多酚、茶多糖等组份对茶叶的抗氧化功效有协同增效作用。土壤的硒含量是决定植物体含硒量的主要因素之一，外源施加硒肥被认为是生产富硒茶的主要有效途径，但高浓度的硒对植物和人类是有害的，因此探究硒浓度对茶的生长和生理的影响，对于系统阐明硒元素对茶树的生物学效应及科学施加硒肥生产富硒茶有现实意义。Hu et al.(2003)报道了在叶片喷洒硒肥(75 g·hm2)可以增加产量，同时茶叶的茶多酚含量明显降低。Xu et al. (2003)发现在叶片喷洒硒肥(50 g·hm2)后茶叶中的茶多酚含量明显增加。这两个报道证实硒能影响茶叶的产量和茶多酚含量，但由于硒浓度处理数目过少，无法解释为何不同的硒浓度作用效果存在差异。曹丹等(2019)在硒浓度为0～1 mmol·L1(即0～80 mg·L1)范围研究沙培茶树的根、茎、叶的硒含量均得到先升后降再升的双峰走势，此结果与许多其他植物中的报道不同。尚庆茂等(1997)通过水培生菜的研究发现营养液中的硒浓度与生菜的硒含量正相关。总之，相关研究在茶树中报道极少，关于硒元素对茶的生长和生理的影响人们还缺乏系统了解，从而阻碍了富硒茶栽培的基础研究和推广。以下科学问题亟需系统解决：(1)需要明确硒元素对茶树是否存在双重效应，应该利用水培或组织培养的方式开展单因素试验以便减少其他营养元素和环境因素的干扰，初步确定产生毒害作用和有益作用的硒浓度阈值;(2)需增加评价指标系统探究硒浓度与茶树生长、茶叶品质的关系，为研究植物的硒毒性和硒活性机制奠定基础;(3)硒对茶树的显微结构和抗逆生理指标的影响未见报道，应进一步搜集相关证据。鉴于此，本研究采用水培试验模型，从植物生长、植物生理、显微结构等方面较系统地探讨了不同硒浓度对茶树的硒累积、生长和生理特性的影响，为研究硒元素对茶树的双重效应机制和富硒茶的栽培提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1 材料与试验设计

　　供试茶苗为黔茶601，材料来自遵义市湄潭县核桃坝御鼎茶业种植基地一年生扦插苗。试验开始前选取长势良好且相对一致的茶苗为材料。

　　试验采用水培方式培养，以小西茂毅营养液(Shigeki， 1995)培育茶苗，元素组成为N 2 850 μmol·L1、K 1 000 μmol·L1、Ca 750 μmol·L1、P 100 μmol·L1、S 2 130 μmol·L1、Mg 1 040 μmol·L1、Al 400 μmol·L1、Fe 6 μmol·L1、B 9 μmol·L1、Mn 18 μmol·L1、Zn 1.5 μmol·L1、Cu 0.4 μmol·L1、Mo 0.5 μmol·L1，营养液pH调至5.5。将上述茶苗移植到通气水培箱(41 cm × 24 cm × 14 cm)中，每箱装有6 L营养液，培育6株茶苗。以Na2SeO4为硒源，设置硒浓度为0(CK)、0.15、0.3、1.5、3、5、8 mg·L1共7个处理，分别记为Se0、Se0.15、Se0.3、Se1.5、Se3、Se5、Se8，每个处理3个重复。试验于2019年6月在遵义医科大学室内进行，试验条件是光照12 h，黑暗12 h，温度25 ℃。每周更换一次营养液，培养30 d后进行形态观察和相关指标的测量。

　　1.2 测定方法

　　1.2.1 茶树生长和茶叶品质指标的测定茶苗培养30 d后，用卷尺(精度0.1 cm)测量每处理组茶苗的株高，重复测定3次取均值。硒处理前后均用电子天平准确称量茶苗鲜重，二者相减得到鲜重增量。采集各组茶苗根系，用蒸馏水清洗后将根系分为新根和老根，将其放入烘箱设定65 ℃分别烘至恒重，用分析天平称量。总根干重为新根与老根的干重之和。

　　采集不同处理组相同部位的成熟茶苗叶片测定叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等各项指标。叶绿素含量测定：取鲜叶0.2 g剪碎至均匀的细条，共3份，用10 mL 95%(V/V)乙醇在弱光下研磨至组织全部变白滤入25 mL棕色容量瓶中，最后在波长为665、649、470 nm下测量吸光度值(李和生，2000)。

　　可溶性糖含量测定：取鲜叶0.3 g，共三份，加入蒸馏水，于沸水中提取30 min，共提取两次，提取液过滤后加入25 mL容量瓶中，在630 nm处测量吸光度值(李和生，2000)。

　　可溶性蛋白含量：取鲜叶0.5 g，共三份，加蒸馏水研磨后离心10 min，提取和收集上清液。取上清液1.0 mL加入考马斯蓝G250溶液5 mL。在波长为595 nm下测量吸光度值(李和生，2000)。

　　茶多酚含量参照GB/T 83132008茶叶中的检测方法，取0.2 g烘干磨碎后的试样于离心管中，加入70%甲醇溶液，水浴浸提，离心后将上清液转移至10 mL容量瓶，移取1.0 mL茶样提取液于用水定容至100 mL，再移取茶样溶液1.0 mL加入5 mL的福林酚试剂，反应时间在5 min左右，加入7.5% Na2CO3溶液。在波长为765 nm下测量吸光度值。

　　1.2.2 茶苗抗逆生理指标的测定硒处理30 d后，取采集不同处理组茶苗的先端一芽三叶测定丙二醛(MDA)、脯氨酸含量、过氧化氢(H2O2)等指标。丙二醛(MDA)：取鲜叶0.5 g用5 mL三氯乙酸 [TCA，5%(W/V)]研磨，取上清液与0.67%硫代巴比妥酸混合后，在波长为532、450、600 nm下测量吸光度值(李和生，2000)。

　　根系活力：取根尖样品0.5 g，加人0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，反应后根取出，与乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内磨碎，提出甲臜。在波长为485 nm下测量吸光度值(李和生，2000)。

　　脯氨酸含量：取鲜叶0.5 g，加人3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2 mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入冰醋酸及酸性茚三酮试剂，后加入4 mL甲苯，吸取上层脯氨酸淡红色甲苯溶液在波长为520 nm下测量吸光度值(李和生，2000)。

　　过氧化氢(H2O2)含量：取0.1 g鲜叶，在冰浴中加入三氯乙酸 [0.1%(W/V)]、KI和磷酸钾缓冲液研磨，匀浆离心后取上清液在波长为390 nm下测量吸光度值(Velikova et al.， 2000)。

　　1.2.3 茶苗硒含量的测定硒含量测定采用石墨炉原子分光光度法(潘虹等，2017)。分别采集不同处理组茶苗的先端一芽三叶和根系，共三份，先用去离子水冲洗鲜叶和根表面，再用去离子水反复冲洗以去除鲜叶和根表面吸附的离子。将鲜叶和根分别烘干并研磨成粉，取0.2 g后加入10 mL 硝酸-高氯酸(5∶1)于电热板上消解，将消解后溶液定容至25 mL。利用石墨炉原子分光光度计测定样品的原子荧光强度，结合硒标准曲线计算总硒含量。

　　1.2.4 茶苗根尖显微特征取新生根尖0.5～1 cm根段，使用番红、固绿染色法制备石蜡组织切片(邹江斌等，2013)，显微镜镜检，采集图像分析。

　　1.3 數据处理与分析

　　采用SPSS 17.0统计分析软件计算各指标的平均值和标准误，使用LSD与Dunnett检验进行差异显著性分析，所得统计结果使用Graphpad Prism 7.0进行图形绘制。

　　2结果分析

　　2.1 不同硒浓度处理对茶苗硒积累的影响

　　以黔茶601茶苗为试验材料实施单因素水培试验，采用石墨炉原子分光光度法研究了硒酸钠浓度(Se 0～8 mg·kg1)对茶苗的硒积累的影响。图1显示，在水培条件下随着硒浓度的增加，茶苗根部和新梢部分的总硒含量均明显增加。地上部分的硒积累曲线与根部高度相似，但是比根部积累更多的硒元素。

　　2.2 不同硒浓度下茶苗生长和光合色素含量的变化情况

　　图2和图3结果显示，合适的硒浓度处理对茶苗根部和茎叶部分的生长有利，随着硒浓度升高茶苗的生长逐渐受到抑制并不断加重。与对照组Se0相比(图2)，Se0.3组茶苗生长较好，叶片翠绿，根系颜色较白，新生侧根数量较多，Se5、Se8组茶苗的成熟叶片出现枯斑，根系颜色逐渐褐黄，新生侧根减少。Se0.3、Se1.5组茶苗的鲜重与Se0相比显著增加，Se3、Se5、Se8组茶苗的鲜重则显著减少(图3：A)。Se0.15、Se0.3、Se1.5组的株高增长量与Se0无显著差异，Se3、Se5、Se8组茶苗的株高增长量则显著减小 (图3：C)。对于茶苗根系生物量而言，Se0.3组茶苗根系总干重以及新根干重与Se0组相比显著增长;而其他硒浓度处理组的新根根系生物量都比Se0低，但无显著差异(图3：B)。

　　2.3 不同硒浓度对茶叶品质生理特性的影响

　　由图5可知，茶苗新梢中的可溶性糖、可溶性蛋白和茶多酚含量变化规律相近，均随硒酸钠浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。Se0.3组与Se0相比可溶性糖含量显著增加;Se3、Se5、Se8组可溶性糖含量均显著减少(图5：A)。与Se0相比，Se0.3组时可溶性蛋白含量增加明显;而Se8组可溶性蛋白则显著减少(图5：B)。Se0.3组茶多酚含量最高;Se3、Se5和Se8组则显著减少(图5：C)。这表明硒对茶苗叶品质生理特性的影响有两面性，在低浓度时有一定的促进作用，而在高浓度时有损害作用。

　　2.4 不同硒浓度对茶苗抗逆生理特性的影响

　　图6：A显示，茶苗的MDA含量会随硒酸钠浓度的增加呈现先降后升的趋势。与Se0相比，Se0.15、Se0.3组MDA含量显著减少;Se1.5、Se3、Se5和Se8组MDA含量则逐渐上升，其中Se8组达到显著差异水平(图6：A)。图6：B和6：C显示，茶苗的脯氨酸和过氧化氢含量的变化规律一致，均随硒浓度的增加呈现先降后升的趋势。与Se0对照组相比，Se0.3、Se1.5组茶苗的脯氨酸显著减少;Se3、Se5、Se8组则显著增加 (图6：B)。与Se0对照组相比，Se0.3、Se1.5组叶片的H2O2含量显著减少;Se3、Se5和Se8组的过氧化氢则显著增加(图6：C)。此外，硒浓度对茶苗根系活力也有显著影响，随着硒浓度的增加根系活力呈先升后降的趋势(图6：D)。Se0.15、Se0.3、Se1.5组的根系活力比对照Se0均有所增加，其中Se0.3组达到最大值，比Se0增加了78.19%(图6：D)。Se3、Se5、Se8组根系活力逐步降低。

　　2.5 不同硒浓度处理下茶苗根尖显微特征的变化

　　通过根尖横切片的显微观察可知，茶树根尖成熟区的初生结构由表皮、皮层、维管柱组成，其中皮层由外皮层、皮层薄壁组织、内皮层构成(图7：A-G)。内皮层的绝大部分细胞能被番红染色，为全面增厚、木栓化的凯氏带;少部分被固绿染色，推测为通道细胞(图7：A，C，E，G)。维管柱中的初生木质部和初生韧皮部相间排列，初生木质部在横切面上呈星角状排列，可观察到三原型(图7：A，D)、四原型(图7：B，C，E，F，G)两种。

　　图7：A-G显示，硒浓度能影响茶苗根尖成熟区的显微特征。在对照组Se0中，表皮层细胞较小，不规则排列于外周;皮层细胞的大小由外向内细胞大小逐渐变小，内皮层凯氏带明显，外皮层细胞外侧番红染色的圈带隐约可见;维管柱的木质部较明显，由外往里细胞逐渐增大(图7：A)。Se0.15、Se0.3、Se1.5组的顯微结构相似：表皮层细胞比Se0增大，排列较规则、整齐;外皮层细胞外侧的番红染色带比Se0清晰;皮层薄壁细胞比Se0更圆润饱满(图7：B，C，D)。随着硒酸钠浓度的增加，Se3、Se5和Se8组根尖的初生结构及内部细胞形态的变化更明显。根尖表皮细胞更大、排列更整齐;外皮层细胞变大，形态排列与表皮细胞接近，番红染色带更明显;皮层薄壁细胞变形、干瘪受损;内皮层凯氏带结构有所变化，被染成绿色的细胞增加;维管柱也随着发生形变，维管柱与根径的比例比Se0有所减小，中央薄壁细胞变小、变形甚至受损(图7：E，F，G)。值得一提的是，上述表征在Se8时最为明显，表明该浓度下细胞受到严重的硒胁迫作用。

　　3讨论

　　3.1 硒浓度与茶苗硒含量、硒分布的关系

　　硒酸钠是可被植物直接利用的硒源的主要形式之一。植物根尖从土壤吸收硒元素后， 转移至A-G分别代表Se0、Se0.15、Se0.3、Se1.5、Se3、Se5、Se8处理的茶苗根尖横切片。epi. 表皮; exo. 外皮层; par. 皮层薄壁细胞; xyl. 木质部; phl. 韧皮部; end. 内皮层; pas. 通道细胞。

　　A-G represent the transverse section of the root tip of tea seedlings treated with Se0， Se0.15， Se0.3， Se1.5， Se3， Se5 and Se8， respectively. epi. Epidermis; exo. Outer cortex; par. Cortical parenchyma cells; xyl. Xylem; phl. Phloem; end. Endodermis; pas. Passage cell.

　　地上部分，在叶绿体和细胞质中转化为有机硒后转移并积累于不同的器官或组织中(White， 2018)。植物种类和器官类型不同，硒元素的积累能力及其在器官或组织中的分布样式通常也会有所差异。生产富硒农产品的本质是在食用或药用部位富集硒元素。因此，了解培养基质中的硒浓度与植物硒含量的关系以及硒元素在植物体内的分布非常必要。茶苗在多个浓度的硒处理下茶叶的含硒量均比根部高，说明茶叶对硒的蓄积能力比根部强，硒酸钠被茶苗吸收后，更多的硒元素转移到植株的地上部分。这既有利于减少硒在根积累产生的毒害作用，也可为外源添加硒肥生产富硒茶叶提供有利条件。生长基质的硒含量是富硒茶生产的主要限制因素。我国大部分地区的土壤硒含量的背景值很低，全国均值只有0.29 mg·L1(魏复盛等， 1991)，因此许多地区生产的茶叶含硒无法满足富硒茶的硒含量标准，例如广东茶区所抽取的35个天然茶叶样品的硒含量为0.124 mg·kg1(梁春燕等， 2014)。本研究基于水培试验证实，茶叶硒积累与营养液的硒酸钠浓度呈正相关。曹丹等(2019)在硒浓度为0～1 mmol·L1(即0～80 mg·L1)范围研究沙培茶树的根、茎、叶的硒含量均得到先升后降再升的双峰走势，这与本研究结果不同。我们推测栽培方式和浓度范围不同可能是造成二者差异原因。尚庆茂等(1997)研究了不同浓度下水培生菜的硒含量情况也证实硒积累与营养液的硒浓度呈正相关。由此可见，在土壤或培养基质中加入足量的硒元素即可达到富硒茶所需的硒标准。据图1测算，约需加入超过0.3 mg·L1(Se)的硒酸钠，才可能生产出符合农业部标准的富硒茶(0.25 mg·kg1)。外源添加硒肥作为低硒地区富硒茶栽培的有效途径，并非意味着硒肥多多益善。高浓度的硒会对植物产生毒害作用，因此添加硒肥生产富硒茶有必要继续探讨硒浓度对茶树的生长和生理的影响。

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