解淀粉芽孢杆菌施用方式对烟株根际土壤真菌群落的影响

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摘要：摘 要：通过大田试验和ITS扩增子测序技术，研究了解淀粉芽孢杆菌不同施用方式[兌水灌根(DS)、拌土围根(BT)、米糠+拌土围根(MK+BT)]对烟株根际土壤真菌群落的影响，旨在为解淀粉芽孢杆菌的科学施用提供理论基

　　摘 要：通过大田试验和ITS扩增子测序技术，研究了解淀粉芽孢杆菌不同施用方式[兌水灌根(DS)、拌土围根(BT)、米糠+拌土围根(MK+BT)]对烟株根际土壤真菌群落的影响，旨在为解淀粉芽孢杆菌的科学施用提供理论基础。结果表明，BT和MK+BT均可显著提高烟株根际土壤真菌群落OTU数量及Sobs、Shannon、Chao1指数，对烟株根际土壤真菌群落结构具有显著影响，提高了土壤中子囊菌门和担子菌门的相对丰度，促使土壤中毛壳属(Chaetomium)、木霉属(Trichoderma)和赤霉菌属(Gibberella)等一些有益微生物比例上升。综合来看，在改善根际土壤真菌群落的作用中，MK+BT>BT>DS。

　　关键词：解淀粉芽孢杆菌;施用方式;真菌群落;多样性

　　植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是一类在植物根际稳定存活，且可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类[1]。相较于传统的化肥施用，PGPR对环境友好，且可持续净化和修复土壤、防控土传病害等。因此，PGPR作为一种微生物肥料越来越受到人们关注[2]。在目前研究较多的PGPR中，芽孢杆菌属(Bacillus)是重要的一类，其中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)通过产生细菌素[3]、伊草枯菌素[4]、寡肽[5]等次级代谢产物和生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和亚精胺等多种生理活性物质[6]，促进番茄[6]、水稻[7]、茶叶[8]、烟叶[9]等作物生长，修复土壤生态环境，提高作物抗病抗逆性。然而，由于土壤环境的复杂性，外源微生物通常很难在土壤中定殖并发挥促生作用。因此，研究认为在PGPR的使用上加以改进是有效发挥其作用的方法之一[10]。然而，目前关于解淀粉芽孢杆菌施用方式的报道甚少，尤其是在植烟土壤的施用方式上报道尚为空白。

　　土壤微生物群落结构反映土壤质量[11]。在土壤微生物中，真菌对土壤环境的变化比细菌更敏感[12]，它参与土壤物质转化、养分循环和能量转化过程，促进土壤团聚体形成，进而改善土壤结构[13]。因此，分析土壤真菌群落结构响应外界环境的变化，对于探寻更为适宜的解淀粉芽孢杆菌施用方式具有重要意义。本研究拟通过田间小区试验和ITS扩增子测序技术，探究解淀粉芽孢杆菌的不同施用方式在改善烟株根际土壤真菌群落中的作用，旨在为进一步提升解淀粉芽孢杆菌的促生效果提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　所使用的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)菌株为YH-22[14]，按相关工艺进行发酵，并干燥为粉剂(1.0×1010 cfu/g);米糠为市售。

　　1.2 试验地点及试验设置

　　试验于2018年在湖北省恩施州宣恩县罗圈岩开展，土壤类型为黄棕壤，基础理化性质：pH 6.25，有机质2.81%，碱解氮、有效磷和速效钾含量分别为112.43 mg/kg、22.74 mg/kg和344.51 mg/kg;烤烟品种为云烟87。

　　试验设置5个处理，各处理随机区组排列，3次重复，小区面积为39.6 m2、种植烤烟60株，行株距为1.2 m×0.55 m。各处理分别为：CK1，清水对照，50 mL/株;CK2(MK)，米糠拌土围根，按照m米糠：m土=3∶50混匀，围根施用，100 g/株;DS(兑水灌根)，按照m菌剂∶m水=1∶500混匀，灌根施用，50 mL/株;BT(拌土围根)，按照m菌剂∶m土=1∶1000混匀，围根施用，100 g/株;MK+BT(米糠+拌土围根)，按照m菌剂∶m米糠∶m土=1∶60∶940混匀，围根施用，100 g/株。其中MK+BT处理先将菌剂和米糠喷水均匀混合，在20～25 ℃温度条件下发酵20～25 d，然后拌土围根。各处理分别于烟株移栽时和移栽后40 d各施一次，每次施用量相同。

　　1.3 烟株根际土壤样品采集

　　烟株移栽后100 d时，在每小區中采集5株烟

　　株(生长发育一致)的根际土壤样品。用取样铲完整挖出烟株根系，敲落与根系结合较松的土壤后，用细刷刷落与根系结合较紧密的土壤(4 mm内)至自封袋中，即为根际土壤。将每小区5株烟株的根际土壤充分混合为一个样品。共计15个土样。土样采集后置于干冰中带回实验室，放置于–80 ℃冰箱保存，用于DNA提取。

　　1.4 土壤真菌群落分析

　　1.4.1 DNA提取及PCR扩增 按照FastDNA Spin Kit试剂盒(MP Biomedicals， USA)的说明提取土样总DNA。以ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3′)为引物对真菌ITS1区进行PCR扩增。扩增体系(30 ?L)为：15 ?L Phusion Master Mix Buffer(2×)，3 ?L引物(2 μmol/L)，10 ?L DNA(1 ng/μL)模板，2 ?L H2O。反应程序为：98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(30个循环);72 ℃ 5 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物合格后进行文库构建，在Illumina Hiseq PE250测序平台进行上机测序(诺禾致源生物信息科技有限公司)。

　　1.4.2 OTU聚类与物种注释 对所有样品的Effective Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类为OTUs(Operational Taxonomic Units)。对OTUs代表序列进行物种注释，用Qiime软件(Version 1.9.1)中的blast方法与Unit数据库进行真菌物种注释分析(设定阈值为E-value=10-5)，获得各分类水平上的群落组成。

　　1.5 数据处理

　　利用R软件绘制真菌群落的稀释曲线图。利用Mothur软件计算α多样性指数(Sobs、Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数)。基于加权Unifrac距离，利用Qiime软件对门分类水平上土壤真菌群落的组成进行UPGMA聚类分析。利用IBM Statistics SPSS 22.0软件中的One-way ANOVA分析真菌群落OTU数量、α多样性指数、物种相对丰度等在各处理间的差异(p<0.05水平)，结果以平均值±标准误差表示。根据样品在属水平上的物种注释信息及相对丰度，对其丰度进行标准化处理(样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值)，并采用HemI软件绘制Heatmap图。

　　2 结 果

　　2.1 根际土壤测序深度评估

　　以真菌有效序列数为横坐标，以OTU数量为纵坐标绘制了土壤真菌群落稀释曲线(图1)。图1表明，在97%相似度的OTUs分类水平下，OTU数量在测序量增加的初始阶段呈现出急剧上升的趋势;随着测序量的不断增加，OTU数量趋于平缓，表明测序数量基本合理，可反映土壤真菌群落绝大多数序列信息。

　　2.2 土壤真菌群落多样性和丰富度分析

　　对根际土壤真菌群落多样性和丰富度进行了One-way ANOVA方差分析(表1)。结果表明，土壤真菌群落OTU数量、Sobs、Shannon和Chao 1指数均以MK+BT处理最高，分别较其他处理高出14.67%～249.47%、17.59%～282.71%、5.95%～142.80%和10.93%～270.76%;其中，MK+BT与BT间无显著差异，但均显著高于其他处理，表明BT和MK+BT处理可显著提升烟株根际土壤真菌群落多样性和丰富度，尤以MK+BT处理增幅明显。

　　2.3 门水平上土壤真菌群落组成分析

　　2.3.1 土壤主要真菌门相对丰度分析 对各处理土壤中主要真菌门的相对丰度进行了分析(表2)。子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉亚门(Mucoromycota)和隐真菌门(Rozellomycota)在各处理土壤中分别占19.49%～43.36%、12.77%～51.43%、0.11%～5.70%、0.14%～3.16%、0.03%～1.95%和0.00%～0.31%。CK1和CK2(MK)中被孢霉门的相对丰度最高，而DS、BT和MK+BT处理中子囊菌门的相对丰度最高。

　　推荐阅读：《中国烟草科学》是中华人民共和国农业部主管，中国农业科学院烟草研究所、中国烟草总公司青州烟草研究所主办的国家级学术性科技核心期刊。

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