转基因大麦B-hordein基因荧光定量PCR方法的建立

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摘要：摘要：为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达，利用SYBR Green I 染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量，通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段，对PCR退火温度、引物浓度等进行优化，结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明

　　摘要：为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达，利用SYBR Green I 染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量，通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段，对PCR退火温度、引物浓度等进行优化，结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明，转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P < 0.05)，B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01) ℃和(80±0.01) ℃处显示特异性单峰，可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I實时定量PCR法。

　　关键词：SYBR GreenⅠ;荧光定量PCR;转基因大麦;B-hordein

　　醇溶蛋白为大麦胚乳中主要的贮藏蛋白，兼具经济和健康价值。人类直接使用大麦时或将其作为食品原料，或用于啤酒酿造[1 ]。大麦醇溶蛋白分为四类，即由hor-2 编码的B醇溶蛋白。hor-1编码的C醇溶蛋白、hor-3编码的D醇溶蛋白、hor-5 编码的γ醇溶蛋白[2 ]。B醇溶蛋白在大麦醇溶蛋白中含量最高，为70%～80%;其次是C醇溶蛋白，其含量为总蛋白的10%～20%[2 - 3 ]。研究认为，醇溶蛋白对啤酒酿造加工具有负面影响[4 ]，采用基因工程育种技术可创制醇溶蛋白相关亚基缺失的专用大麦品种[1 ]。近年应用RNAi抑制大麦C-hordein或小麦ω-gliadin成功改变禾谷类作物贮藏蛋白组 成[5 - 6 ]。我们的前期研究以大麦模式品种Golden Promise幼胚为受体材料，利用RNAi抑制大麦B-hordein合成，获得的转基因大麦醇溶蛋白含量降低，总蛋白含量降低1%～2%[7 ]，现已获得纯系材料，但转基因大麦B-hordein表达量相对于对照如何变化，其在转录水平的表达是否有遗传稳定性尚不明确。Kaczmarczyk等[3 ]建立实时荧光定量PCR平台来定量大麦发育进程中高度同源的醇溶蛋白多基因家族，但国内尚未见大麦贮藏蛋白功能标记研究相关报道。

　　实时荧光定量PCR技术因其特异性、稳定性、自动化程度高等优点已被广泛应用于转基因检测、作物育种、医疗等领域[8 - 10 ]。为研究转基因大麦醇溶蛋白基因的表达模式，我们建立了大麦发育阶段籽粒主要贮藏蛋白B-hordein表达的定量方法，以期为明确大麦贮藏蛋白基因对于不同环境的响应变化和该基因功能标记开发提供方法参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 供试材料 供试材料为甘肃农业科学院生物技术研究所创制的RNAi B-hordein 的转基因大麦及对照Golden Promise。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 SYBR Premix x TaqTM II购自宝生物工程(大连)有限公司，植物总RNA提取试剂盒(DP441)购自北京天根生化有限公司，反转录试剂盒(c81401190)购自上海英骏生物技术有限公司。主要仪器设备为ABI QuantStudio5 Q5荧光定量PCR仪，NanoDrop one。

　　1.1.3 引物设计与合成 用于荧光定量PCR的大麦内参基因actin(AY145451)引物用Primer Premier 5.0 软件设计(表1)，目的基因B-hordein引物同Kaczmarczyk等[3 ]。

　　1.2 试验方法

　　试验于2016年3 — 7月种植于甘肃省农业科学院生物技术研究所转基因专用温室，人工条播，行长1 m，行距为20 cm，小区面积为4 m2，3次重复，随机区组排列。

　　1.2.1 籽粒胚乳总RNA的提取及反转录 花后对RNAi株系挂牌标记。转基因株系和对照均选取3个生物学样本。花后10 d 9：00～10：00时从每个单株穗中部选取发育籽粒2粒，迅速置于液氮中冷冻保存，之后于-80 ℃贮存备用。

　　采用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚总RNA提取试剂盒提取大麦籽粒RNA。每样本取2 μL RNA用NanoDrop one测定260、280 nm处的吸光值(以无 RNase 水为空白液调零)。计算A260/280的值，估算总RNA的纯度，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

　　取各样本RNA 0.02 μg，按照Invitrogen GoldScript cDNA合成试剂盒进行操作，合成cDNA第1链。以cDNA及RNA为模板，进行内参基因actin PCR扩增。用于PCR的actin引物序列與反应程序同李静雯等[7 ]。

　　1.2.2 B-hordein的普通PCR 以反转录cDNA 为模板，Common BF/BR扩增目的基因B-hordein，在其他条件不变的情况下，分别对引物浓度和退火温度进行优化，引物浓度为0.1～0.5 μmol/L，退火温度为56～62 ℃内进行优化。

　　1.2.3 SYBR GreenⅠqRT-PCR反应程序 采用SYBR GreenⅠ染料法，在Q5定量PCR仪上进行目的基因B-hordein和内参基因actin检测。按照TB GreenTM Ex TaqTM II 说明建立反应体系，1 μL 100 ng/μL cDNA，每个模板3个重复。反应程序为：95 ℃变性3 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，进行35个循环。在72 ℃延伸阶段进行末点荧光检测，每上升0.5 ℃收集1次荧光基因表达相对量，采用2-ΔCt方法计算[9 ]。

　　1.3 数据处理

　　分别用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0进行数据处理和方差分析 。

　　2 结果与分析

　　2.1 RNA的纯度和完整性

　　采用TIANGEN RNAprep Pure 多糖多酚总RNA提取试剂盒(DP441)提取转基因大麦和对照花后10 d的籽粒RNA。所提总RNA中28S rRNA和18S rRNA条带清晰可见清晰，二者比例接近2∶1，电泳条带无拖尾，表明RNA无降解，蛋白质和多糖等杂质去除较干净，且加样孔内无任何基因组DNA 残留，质量相对较好(图1)。RNA样品的A260/A280值为1.88～2.11，说明样品具有较高的纯度，可满足下一步反转录实验要求。

　　2.2 cDNA的合成及检测

　　采用内参引物同时扩增所提取RNA及反转录获得的cDNA。结果表明(图2)，所提取RNA样本未扩增出内参基因目的条带，相应的cDNA均扩增出540 bp大小的目的条带，表明所提取的RNA无基因组DNA污染，并且cDNA反转录成功，可用于荧光定量PCR实验。

　　2.3 B-hordein的普通PCR

　　以反转录的cDNA为模板，分别在引物浓度为0.1～0.5 μmol/L、退火温度在56～62 ℃条件下进行优化。最终引物浓度为0.3 μmol/L，退火温度为57 ℃。得到约119 bp的目的片段，与预期结果一致(图3)。

　　2.4 实时荧光定量PCR的优化条件

　　在普通PCR的基础上，获得了B-hordein基因实时荧光定量PCR的最佳反应体系和条件。优化后的反应体系为10 uL：SYBR Premix ex Taq 5 uL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 uL，100 ng/μL cDNA 1 uL;去离子水3.2 uL;反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，进行35 个循环。最佳退火温度为57 ℃，最佳引物终浓度为0.4 μmol/L。

　　2.5 扩增曲线和溶解曲线分析

　　以优化好的条件进行荧光定量qRT-PCR 扩增，扩增样品同一引物的扩增曲线平滑，且相同样品的3次扩增曲线位置相近(图4)，表明不同样品中相同引物的扩增效率一致，重复性好。B-hordein和actin扩增片段分别在熔解温度(84.51±0.01) ℃和(80±0.01) ℃处显示特异性单峰(图5)，说明实时荧光定量PCR引物特异性较好，实验数据准确。

　　2.6 转基因大麦花后10 d的籽粒B-hordein基因表达分析

　　采用已建立的SYBR GreenⅠqRT-PCR方法，对转基因大麦及对照花后10 d B-hordein 基因表达进行定量分析。结果(图6)表明，相对于对照，RNAi转基因大麦B-hordein表达量显著降低(P < 0.05。

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