人类白细胞抗原等位基因与HBV宫内感染关系

来源：核心期刊咨询网核心期刊论文2013-07-11 16:011

摘要：【关键词】 乙型肝炎病毒；宫内感染；人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)； 医学核心期刊论文发表 摘要： 目的 研究人类白细胞抗原(HLA)-DR3、DR7、DR13、DR53等位基因与乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)宫内感染的关系，探讨HBV宫内感染的遗传易感性，

　　【关键词】  乙型肝炎病毒；宫内感染；人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)；医学核心期刊论文发表

　　摘要： 目的   研究人类白细胞抗原(HLA)-DR3、DR7、DR13、DR53等位基因与乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)宫内感染的关系，探讨HBV宫内感染的遗传易感性，确定HBV宫内感染的易感基因和保护基因。方法   采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿各187例外周静脉血血块中HLA-DR3、DR7、DRl3、DR53等位基因型分布及频率。结果   (1)宫内感染组孕妇HLA-DR3基因频率为2414％(7／29)，显著高于非宫内感染组孕妇的633％(10／158)(P=0007)。其余各表型比较，差异无统计学意义(P>005)。(2)宫内感染组新生儿HLA-DR3基因频率为1724％(5／29)，显著高于非宫内感染组新生儿的506％(8／158)(P=0033)。其余各表型比较，差异无统计学意义(P>005)。(3)母婴HLA-DR3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较差异有统计学意义(P=0049)；母婴HLA-DR7、DR13、DR53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，差异无统计学意义(P>005)。结论   HBsAg阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带HLA-DR3，易导致HBV宫内感染；HLA-DR3是HBV宫内感染的易感基因。

　　Association between HLA-DR alleles and HBV intrauterine infection
　　FENG Yongliang,WANG Suping,SHI Xiaohong,et al.
　　Department of Epidemiology,Shanxi Medical University (Taiyuan 030001，China)
　　Abstract： Objective   To study the association between HLA-DR3,DR7,DR13,DR53 and HBV intrauterine infection to probe into the susceptibility to intrauterine infection of hepatitis B virus and to find its predisposing genes and protecting genes.Methods   HLA-DR3,DR7,DR13,DR53 were detected by the technique of polymerase chain reaction-sequence specific primers(PCR-SSP) in maternal and neonatal blood clot.Results   (1) The frequency of HLA-DR was 24.14% in women with intrauterine infection,which was higher than that (6.33%) in women without intrauterine infection(P=0.007).There was no association between HLA-DR7,DR13,DR53 positive in pregnant women and HBV intrauterine infection(P>0.05).(2) The frequeney of HLA-R of newborns was 17.24% in women with intrauterine infection,which is higher that (5.06%) in women withotll infection(P=0.033).There was no association between HLA-DR7,DR13,DR53 positive in newborns and HBV intrauterine infection(P>0.05).(3)There was significant association between HLA-DR3 concordance and HBVintrauterine infection(P=0.049).There was no association between DR7,DR13,DR53 concordance and HBV intrauterine infection(P>0.05).Conclusion   HLA-DR3 carriers of pregnant women and their newborns have susceptibility to HBV intrauterine infection.HLA-DR3 is the predisposing gene of HBV intrauterine infection.
　　Key words： HBV；intrauterine infection；HLA-DR antigen

　　肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病，我国是乙肝高发区，乙肝病毒的母婴传播不仅造成人群中众多的HBsAg携带者，而且是引起成人慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要因素。迄今，多数学者认为，人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关，而HLA-DR等位基因与HBV宫内感染的关系争议较多。本文通过研究HLA-DR3、DR7、DR13、DR53与HBV宫内感染的关系，探讨HBV宫内感染的遗传易感性，为防制HBV宫内感染提供理论依据。

　　1   对象与方法
　　11   对象   以2003年6月～2004年11月太原市省各市级医院筛检，并在太原市传染病院妇产科进行产前检查及分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿各187例作为研究对象。并根据新生儿有无宫内感染，分为宫内感染组(29例)和宫内未感染组(158例)，2组在年龄分布、文化程度、职业构成等均衡可比。
　　12   方法
　　121   标本采集及处理   收集孕妇肘静脉血及新生儿出生24h内且未注射高效价免疫球蛋白(HBIG，hepatitis B immune globulin)的股静脉血各2ml，4℃冰箱保存，6h内以4000r/min4℃离心15min，分离血清与血块，-20℃保存备检。
　　122   乙肝血清标志物检测   采用酶联免疫吸附(ELISA)法，试剂盒（上海科华实业总公司）。
　　123   HBV DNA检测   (1)HBV DNA提取：参考文献〔1〕，采用异硫氰酸胍一步法提取血清DNA；(2)HBV DNA的扩增：采用巢式聚合酶链反应(nPCR)。
　　124   HLA-DR等位基因检测   (1)人类基因组DNA的提取十二烷基磺酸钠（SDS）蛋自酶K法提取血块基因组DNA。(2)HLA-DR等位基因扩增：参考文献〔2〕的引物设计采用聚合酶链反应／序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测孕妇及其新生儿外周静脉血血块中HLA-DR3、DR7、DR13、R53基因型分布及频率。(3)PCR产物的检测：取扩增产物5～10μl，按5：1(V：V)与溴酚兰混匀，加样于15％琼脂糖凝胶(含05μg／ml溴化乙锭)板，在60V／cm电压下泳动50min，紫外灯下观察结果。
　　125   新生儿HBV宫内感染诊断标准   新生儿外周血血清HBsAg和/或H阳性，即诊断为HBV宫内感染。
　　13   统计分析
　　资料输入SPSS115软件进行统计分析；计算各指标的阳性率，四格表χ2、Fisher确切概率、OR值及OR95%CI。

　　2   结果
　　21   HBsAg阳性孕妇及其新生儿HLA-DR扩增图谱   提取的血块DNA经PCR扩增后呈现明显条带，与标准分子标记物（Marker）条带比较，确定HLA-DR基因型（图1，2，3，4）。
　　DR3+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阳性扩增产物，扩增产物片断长度为151bp;DR3-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)
　　图1   HLA-DR3等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）
　　DR7+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阳性扩增产物，扩增产物片断长度为232bp；DRT-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)
　　图2   HLA-DR7等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）
　　DR13+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阳性扩增产物，扩增产物片断长度为130bp；DR13-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)
　　图3   HLA-DR13等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）
　　DR53+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阳性扩增产物，扩增产物片断长度为213bp；DR53-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阴性扩增产物；C：内对照
　　注：DR53引物与内对照引物可能发生了引物间的错配等，故分管同时扩增
　　图4   HLA-DR53等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）
　　22   HLA-DR与HBV宫内感染的关系
　　221   孕妇HLA-DR等位基因分布及频率比较（表1）   宫内感染组孕妇HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义（OR=4709,P=0007）；HLA-DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组孕妇比较，经检验，差异无统计学意义（P>005）。
　　表1   宫内感染组与宫内未感染组孕妇HLA-DR基因分布及频率比较（略）
　　注：*为fisher确切概率法计算结果
　　222   新生儿HLA-DR等位基因分布及频率比较(表2)   宫内感染组新生儿HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义(OR=3906，P=0033)；HLA-DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组新生儿比较，经检验，差异无统计学意义(P>005)。
　　223   母婴HLA-DR等位基因同阳性分布及频率比较（表3）   母婴HLA-DR3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经检验，差异有统计学意义（OR=596,P=0049），母婴HLA-DR7、DR13、DR53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经验验，差异无统计学意义（P>005）。
　　表2   宫内感染组与宫内未感染组新生儿HLA-DR基因分布及频率比较（略）
　　注：*为fisher确切概率法计算结果
　　表3   宫内感染组与宫内未感染组母婴HLA-DR同阳性分布及频率比较（略）
　　注：*为fisher确切概率法计算结果

　　3   讨论
　　KilpatrickDC〔3〕的研究发现，HLA-A3是人类免疫缺陷病毒(HIV)宫内感染的保护基因，HLA-DR3是HIV宫内感染的易感基因。Bosi L等〔4〕采用Logistic回归分析发现，HLA-DR13与发生HCV宫内感染呈负相关，即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素。在母亲同时感染HIV者中，HLA-DR13和HIV同时感染在HCV宫内感染的发生中具有独立而相反的作用，即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素；HLA-DR13表达在未发生HCV，宫内感染和发生了HCV宫内感染者的OR值为84(95％CI=11～608)，且母乳喂养不影响该HCV宫内感染的危险度。王素萍等〔5〕以HBsAg阳性孕妇新生儿为研究对象，随机选择发生及未发生HBV宫内感染的新生儿各20例，应用试剂盒提供的序列特异性引物(sequence specific primers,SSP)采用PCR-SSP技术扩增HLA-DR基因区18对等位基因，判定HLA-DR抗原的型别，计算HLA-DR抗原各型别出现频率并分析其在2组间的差别，发现DR3、DR51在宫内感染组的频率较高，分别为45％，40％。在非宫内感染组分别为20％，15％，P值分别为018，016。DR53在非宫内感染组的频率较高，为60％，在宫内感染组为35％。推测HLA-DR3、DR51可能是HBV宫内感染的易感型，而DR53有可能是具有保护作用型别。刘海英等〔6〕采用PCR-SSP法合成相应的特异性引物序列，对HLA-DR3、DR4、DR13、DR15进行研究。结果显示，宫内感染组孕妇HLA-DR3的基因频率为50％，显著高于宫内未感染组的147％(RR=58，χ2=490,P<005)，其余各基因表型比较，差异无统计学意义；宫内感染组新生儿HLA-DR3的基因频率为30％，明显高于宫内未感染组的74％，但差异无统计学意义(P>005)，提示孕妇或胎儿携带HLA-DR3，易导致HBV宫内感染，即孕妇或胎儿HLA-DR3阳性是HBV宫内感染的易感基因。本文同样采用PCR-SSP技术研究HLA-DR特异性等位基因与HBV宫内感染的关系。结果表明，HBsAg阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带HLA-DR3，易导致HBV宫内感染；HLA-DR3是HBV宫内感染的易感基因。提示在防制HBV宫内感染时不能忽视人类遗传因素的作用，应采取综合措施防制HBV宫内感染。

　　参考文献
　　〔1〕   向海平，郭雁宾，孟庆华，等.聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床意义分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13（1）：89-90.
　　〔2〕   Olerup O,Zetterquist H.HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR-SSP)in 2 hours:an alternativa to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation［J］.Tissue Antigens,1992,39:225-229.
　　〔3〕   Kilpatrick DC,Hague RA,Yap PL,et al.HLA antigen frequencies in children born to HIV-infected mothers［J］.Dis Markers,1991,9(1):21-26.
　　〔4〕   Bosi I,Ancora G,Mantovani W,et al.HLA-DR13 and HCV vertical infection 〔J〕.Pediatr Res,2002，51(6)：746-749.
　　〔5〕   王素萍，孔宪毅，薛淑莲，等.HLA-DR抗原与HBV宫内感染关系研究［J］.中国公共卫生，2003，19（7）：772-774.
　　〔6〕   刘海英，孔北华，罗霞，等.乙型肝炎病毒母婴垂直传播与人类白细胞抗原DR区域基因相关性的研究［J］.中华妇产科杂志，2003，38（10）：599-603.