龙眼体细胞胚胎发生早期SDG基因家族的全基因组鉴定与表达分析

来源：核心期刊咨询网时间：2019-12-19 10:3312

摘要：摘 要 SET domain group(SDG)基因家族控制的組蛋白赖氨酸甲基化，是参与染色质功能调控和表观遗传调控基因表达的重要部分。为了解龙眼(DlSDG)家族的生物学功能，采用生物信息学分析方法进行龙眼全基因组SDG家族成员的鉴定，并对蛋白质结构域、保守基序、基因

　　摘 要 SET domain group(SDG)基因家族控制的組蛋白赖氨酸甲基化，是参与染色质功能调控和表观遗传调控基因表达的重要部分。为了解龙眼(DlSDG)家族的生物学功能，采用生物信息学分析方法进行龙眼全基因组SDG家族成员的鉴定，并对蛋白质结构域、保守基序、基因结构、启动子顺势作用元件、进化树、相关基因的蛋白互作和体胚发生早期的基因表达情况进行预测和分析。结果显示，龙眼SDG家族基因包括32个成员，分为Suv、Ash、ATXR5/ATXR6、Trx、E(z)、SMYD和SETD 7个亚家族，其中Suv亚族成员数量最多;外显子数量在1～22个不等，蛋白结构域保守，都含有一个SET结构域，DlSDG蛋白保守motif不同亚家族间差异较大;DlSDG启动子包含许多诸如低温、干旱和压力等非生物胁迫响应元件和激素响应元件;龙眼SDG成员在体胚发生早期均能不同程度表达，其中DlSUVR4b在EC和ICpEC阶段可能发挥着较为重要的作用;DlSUVH4可以和DNA甲基转移酶MET1发生互作。本研究表明，龙眼DlSDG 32个组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因可能除了在生物钟的调节、植物发枝数量、根的生长发育、种子的萌发、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要功能外，也可能直接参与胁迫响应和体细胞胚胎发生的调控，并且还可能在参与DNA甲基化、染色质重塑的过程中形成体细胞胚胎发生的协作调控网络，表现其具有功能上的多样性、复杂性。

　　关键词 龙眼;组蛋白赖氨酸甲基转移酶;成员鉴定;功能分析;表观遗传

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　　在植物表观遗传学快速的发展背景下，植物组蛋白修饰作为重要的表观遗传调控手段已日益成为研究的热点。组蛋白修饰同DNA甲基化、染色质重塑和非编码RNA调控一样是表观遗传调控的重要机制之一。真核生物中基因组DNA和组蛋白组装在一起形成染色体。首先，组蛋白H2A、H2B形成二聚体，H3、H4形成四聚体，而染色质的核心组成单位八聚体由2个H2A、H2B二聚体和1个H3、H4四聚体组成，经146 bp的DNA缠绕形成染色体的基本组成单元核小体[1-3]。作为调控核小体结构的主要方式，组蛋白翻译后修饰主要包括甲酰化(Formylation)、乙酰化(Acetylation)、甲基化(Methylation)、磷酸化(Phosphorylation)、泛素化(Ubiquity lation)、抑制基因表达的SUMO(small ubiquitin-like modifier modification，SUMOylation)化、ADP(ADP-ribosylation)核糖基化等修饰方式[4-7]，且多发生在N端，多种组蛋白修饰结合与排列在一起构成了组蛋白密码[8]，组蛋白与组蛋白、组蛋白与DNA的互作受到组蛋白密码的影响从而调控基因的转录与表达[9]。组蛋白甲基化修饰是最为复杂的植物组蛋白修饰方式，表现出修饰位点多样性和不同程度的修饰。

　　植物组蛋白赖氨酸甲基化共价修饰主要依赖赖氨酸甲基转移酶来完成，含有SET结构域的SDG(SET domain group)是植物中唯一存在的具有组蛋白甲基转移酶活性的蛋白家族。赖氨酸甲基转移酶(histone lysine mathylatransferases，HKMTs)是两类组蛋白甲基转移酶的一大类，在植物中共发现17个组蛋白赖氨酸甲基化位点和7个精氨酸甲基化位点。组蛋白甲基化常发生在组蛋白H3、H4的赖氨酸(K)和精氨酸(R)的残基上，赖氨酸残基上发生最为常见。

　　组蛋白赖氨酸甲基化修饰主要通过改变赖氨酸残基甲基化状态和程度，介导转录沉默与染色质的活化而不改变修饰位点携带的电荷量，从而提高组蛋白疏水性，改变组蛋白分子内部和分子间的相互作用，也可通過含有识别甲基化信号特定结构域的阅读器来实现[10]。组蛋白赖氨酸甲基化可以发生单甲基化、双甲基化和三甲基化3种不同程度的甲基化形式，其甲基化程度可以通过赖氨酸甲基转移酶和赖氨酸去甲基转移酶调控维持动态平衡[10]。H3和H4组蛋白中分别有5个(K4、K9、K27、K36、K79)赖氨酸残基和1个(K20)赖氨酸残基可被甲基化。一般H3K4、H3K36和H3K79甲基化通常和参与基因转录的激活有关，H3K9、H3K27和H4K20甲基化则和参与基因的转录抑制相关[11]。

　　组蛋白赖氨酸甲基转移酶在植物的生长发育中发挥着重要作用。组蛋白赖氨酸甲基化可以通过调控春化途径从而参与开花、促进花粉发育的过程[12-13];还可以参与启动植物种子萌发、调节根的生长发育、调节生物钟以及与拟南芥的发枝数量等[14-17]。组蛋白赖氨酸甲基化能够介导植物体细胞胚胎发生相关基因的表达，从而参与对体细胞胚胎生长发育过程的调控，并且植株的形态建成等完整生命过程均有组蛋白甲基化修饰的参与[18]。此外，组蛋白赖氨酸甲基转移酶常通过调控基因的表达而参与各种胁迫应答反应。综上，提示组蛋白赖氨酸甲基化几乎参与了植物生长发育的所有过程。

　　龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国重要的热带、亚热带常绿木本果树，果实富含蛋白质、氨基酸、类黄酮和多酚多种物质，营养价值和药用价值极高[19]，其胚胎发育情况很大程度上影响果实产量、品质和可食用率，但在龙眼生长发育的过程中仍然存在核大、可食率低的问题。赖钟雄等[20-21]以龙眼幼胚为材料建立了龙眼松散型胚性愈伤组织系，进行长期保持，并以此为基础开展了大量与龙眼体细胞胚胎发生相关的研究。但在龙眼体细胞胚胎发生的进程中关于组蛋白赖氨酸甲基转移酶的研究未见报道。

　　据其他植物研究报道，组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因MEA在胚胎和胚乳中表达，并通过基因组印迹参与胚胎和胚乳的发育[22-23]。因此，鉴于SDG在高等植物尤其是木本果树胚胎发育过程中潜在的生物学功能，进一步的分析鉴定很有必要。在本实验室龙眼基因组破译的基础上，基于基因组开展龙眼体胚发生早期组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因家族的生物学功能研究，不仅对龙眼生物技术的发展具有极大的意义，也对无患子科甚至所有木本植物体胚发生过程中组蛋白甲基转移酶的研究具有重要借鉴意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　采用本实验室最新精确组装的龙眼基因组及全转录组数据库(待发表)进行分析。拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜橙(Citrus sinensis)基因序列、氨基酸序列下载于https：//phytozome. html;水稻(Oryza sativa)氨基酸序列下载于Rice Annotation project Database(RAP-DB)[24]。

　　1.2 方法

　　1.2.1 龙眼DlSDG基因家族成员鉴定 为对龙眼DlSDG家族进行鉴定，首先选取模式植物拟南芥SDG氨基酸序列，经龙眼数据库同源比对，结合NCBI Blast分析，初步筛选确定37条具有完整开放阅读框的龙眼DlSDG候选序列。采用DNAMAN 6.0进行gDNA、CDS、氨基酸序列比对，其中Dlo032596、Dlo027491注释一样，经DNAMAN同源比对，Dlo032596、Dlo027491的CDS序列Identity为52.51%，氨基酸为42.38%，视为2条基因，分别命名为SUVH4a、SUVH4b;Dlo020952、Dlo020987的氨基酸同源比对显示Identity为97.43%，CDS为97.96%，且5?端完全重合，选取Dlo020952进行后续分析;Dlo014820、Dlo034485的氨基酸和CDS同源比对显示Identity均为100%，后续选取Dlo014820进行分析。结合SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)和Pfam结构域预测分析和Softberry基因全长预测分析，最终确定了龙眼基因组中存在32条DlSDG序列。

　　1.2.2 龙眼DlSDG基因染色体定位与进化树构建 根据拟南芥SDG成员在龙眼基因组中的查找注释，参考拟南芥的命名方法对龙眼DlSDG基因家族成员进行命名。采用MEGA7的ClustalW对32个DlSDG基因家族成員氨基酸序列进行多序列比对分析，用进化树构建软件的Neighbor- joining method临近法对龙眼、拟南芥、水稻、甜橙4个物种140条SDG基因家族成员的氨基酸序列进行系统进化树构建，Bootstrap值设置为1000。采用TBtools[25]进行龙眼SDG基因染色体位置示意图绘制。

　　1.2.3 龙眼DlSDG基因结构及蛋白结构域分析 采用TBtools[25]软件，利用龙眼gff文件和genome文件对龙眼DlSDG家族32个成员进行基因结构预测和分析;采用ExPASy对32条DlSDG氨基酸序列进行蛋白的等电点(pI)、分子量(Mw)、氨基酸数目等数据的分析;通过MEME(multiple expectation maximization for motif elicitafion)(http：//meme-suite.org/tools/meme)进行龙眼DlSDG的保守基序分析，采用TBtools的可视化分析与motif图片绘制。采用SMART和Pfam对龙眼DlSDG进行蛋白结构域在线预测，利用TBtools进行蛋白结构域示意图绘制。

　　1.2.4 龙眼DlSDG启动子分析 采用TBtools进行龙眼DlSDG基因起始密码子ATG上游2000 bp序列的提取。采用PlantCARE(http：//bioinform a

　　tics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站在线预测分析龙眼DlSDG不同成员的启动子特征和顺势作用元件功能特点，采用TBtools进行可视化绘图。

　　1.2.5 龙眼DlSDG成员蛋白互作预测分析 利用STRING(https：//string-db.org)网站进行蛋白质互作预测、利用k均值聚类算法进行4个聚类分析，选用研究最深入的拟南芥作为参考，最低互动评分要求选择highest confidence(0.900)探究DlSDG成员自身之间、与其他蛋白之间的互作情况。

　　1.2.6 龙眼DlSDG家族体胚发生早期阶段表达分析 为更深入的了解DlSDG在体细胞胚胎和不同组织器官中可能具有的功能特点，利用龙眼转录组数据库提取DlSDG基因在不同体胚发生阶段胚性愈伤组织(EC)、不完全胚性紧实结构(IcpEC)、球形胚(GE)特异表达的FPKM值，分析家族各成员的表达情况。利用TBtools绘制表达热图。

　　2 结果与分析

　　2.1 龙眼DlSDG家族基因鉴定与蛋白特性分析

　　在龙眼中获得了32个SDG家族成员。通过NCBI Blast双向比对，与模式植物拟南芥、单子叶子植物水稻和木本果树甜橙家族成员进行系统进化分析，将其命名情况见表1。SDG家族蛋白特性分析发现，该基因家族氨基酸长度相差较大，有336～2426 aa，大部分在1000 aa以下，蛋白分子量在36.33～275.37 ku之间，等电点(pI)为4.82～9.05(表1)。

　　2.2 龙眼DlSDG家族基因染色体定位分析

　　DlSDG家族基因染色体定位预测发现，赖氨酸甲基转移酶家族基因成员能精确定位在组装好的染色体上，在龙眼基因组组装好的15条染色体中，染色体3、10、12没有DlSDG成员分布(图1)。DlSDG基因在染色体上分布不均匀，其中1、5、6、7、9、13、15号染色体均分布3个以上的赖氨酸甲基转移酶家族成员，以6号染色体最多，存在6个成员的分布，4、11、14号染色体最少，均只有1个成员分布。为分析DlSDG基因家族成员数量的庞大是否因为基因的串联重复导致，参考Huang等[26]的方法进行串联重复分析，结果表明DlSDG家族成员无串联复制现象存在(表1)。

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