低温对水稻突变体cisc(ta)苗期抗氧化系统和氨基酸积累的影响

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摘要：摘要 [目的]對低温胁迫下苗期水稻(Oryza sativa L.)进行耐冷性生理学和形态学鉴定，为耐冷相关基因定位和克隆奠定基

　　摘要 [目的]對低温胁迫下苗期水稻(Oryza sativa L.)进行耐冷性生理学和形态学鉴定，为耐冷相关基因定位和克隆奠定基础。[方法]以耐冷籼稻材料P1211和冷敏型籼稻突变体cisc(ta)为试验材料，于苗期在人工气候箱中进行低温胁迫处理(12 ℃)，以适温处理(25 ℃)的参试材料作为对照，研究低温胁迫对水稻冷敏感突变体cisc(ta)苗期抗氧化系统和氨基酸积累的影响。[结果]与适温处理相比，P1211和cisc(ta)在低温下幼苗株高、冠鲜重、冠干重、最长根长、根鲜重、根干重显著下降;同时叶片抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)，可溶性蛋白，光合色素含量不同程度降低，冷敏型籼稻突变体cisc(ta)幼苗的降幅大于耐冷籼稻材料P1211;此外，在长期低温胁迫下，突变体cisc(ta)叶片丙二醛含量极显著增加，而P1211无显著差异。低温胁迫后P1211和突变体cisc(ta)的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸含量极显著增加，而亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的含量极显著降低，其中突变体cisc(ta)精氨酸的含量增幅最大。恢复正常处理后，突变体cisc(ta)叶片光合色素含量恢复到正常(CK)水平，但株高显著变矮，成熟期结实率和产量降低。[结论]低温胁迫处理影响突变体cisc(ta)幼苗生长特性，降低了叶片抗氧化酶活性，提高了脯氨酸和游离氨基酸的含量。该研究加深了对水稻苗期耐冷性生理基础的全面认识，并为相关基因的克隆及水稻耐冷分子育种奠定基础。

　　关键词 水稻;低温胁迫;耐冷性;抗氧化系统;游离氨基酸

　　水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的禾谷类作物，也是超过50%人口的主要粮食。需要培育具有高产潜力和对逆境胁迫具有强且持久抗性的品种，以满足人们对水稻的需求。水稻起源于热带/亚热带地区，因此对低温胁迫非常敏感，低温冷害对水稻造成多种损害，包括种子发芽不良、幼苗失绿白化或枯萎、分蘖减少、孕穗期不育以及抽穗开花期颖壳不张开、花药不开裂、花粉不发育而造成不育[1-3]。因此，低温冷害是限制水稻产量和种植面积扩大的世界性问题。近年来，直播水稻因成本低、操作简洁而在世界范围内得到广泛应用。然而，将预发芽种子直接播种在冷水田里很容易受到冷胁迫的影响，提高水稻在萌发期和芽期的耐冷性成为直播水稻品种选育过程中的主要难题。因此，鉴定水稻耐冷性相关基因，深入了解水稻对冷胁迫的反应机制，将有助于水稻耐寒性的遗传改良。

　　植物在冷胁迫下会发生许多生理变化，包括对细胞膜的直接和间接损伤。冷胁迫可以使细胞膜受到损伤，引起电解质渗漏，同时破坏细胞环境，導致细胞器功能下降[4-5]。光系统II (PSII)被认为是与逆境胁迫或衰老相关的光合作用元件损伤的主要部位[6]，而冷胁迫下PSII损伤可引起叶绿素荧光强度的变化。低温胁迫导致亚细胞内活性氧(ROS，如H2O2、O2-和HO-)的积累[7]。这些过多的活性氧在低温下不仅破坏细胞膜和叶绿体结构，抑制光合作用和叶绿素荧光，而且会导致蛋白质、DNA和脂类的氧化损伤，进一步导致细胞功能受损甚至植株死亡[8]。丙二醛(MDA)是磷脂中不饱和脂肪酸过氧化的产物，是导致冷胁迫下细胞膜损伤的主要原因[9-10]。植物已经建立了利用防御酶提高抗寒能力的高效活性氧清除体系，防御酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)，这些防御酶在植物细胞中对ROS的积累起积极的抑制作用[11]。同时，植物也可以通过增加可溶性蛋白、可溶性糖、游离氨基酸和脱落酸(ABA)等渗透物质的含量来减少冷胁迫造成的损害[12-13]。游离氨基酸具有很强的亲和性，能增加细胞液的浓度，对原生质的保水能力及胶体稳定性有一定作用[14]，游离氨基酸中的脯氨酸广泛参与渗透调节、碳氮代谢，保护多数酶类物质，增强植物抗低温胁迫能力[15]。

　　水稻苗期耐冷性形态学和生理学的准确鉴定是耐冷相关基因定位和克隆的基础。该研究以耐冷籼稻材料P1211和冷敏型籼稻突变体cisc(ta)为试验材料，进行低温胁迫处理，检测其表型特征、抗氧化生理指标和氨基酸积累的差异。深入分析冷敏型籼稻突变体cisc(ta)幼苗在低温胁迫下的生长变化和生理特性，为鉴定和分离出水稻耐冷胁迫潜在的候选基因，并全面、深入了解水稻耐冷性的分子机制奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料 突变体cisc(ta)是在重庆渝东南农业科学院开展水稻育种过程中发现的1个苗期低温失绿突变体，材料命名为cisc(ta)(cold-induced seedling chlorosis)。经连续多代自交得到纯合的稳定遗传株系。籼稻材料P1211和突变体cisc(ta)的秧苗经低温胁迫处理后进行表型特征观察和相关生理指标测定，均以适温(25 ℃)处理条件下的P1211和突变体cisc(ta)为对照。

　　1.2 低温胁迫处理 各选取P1211与突变体cisc(ta)籽粒饱满的种子进行浸种、催芽，将萌发一致的芽谷分别播种于8 个塑料盘中，置于人工气候箱中，在28 ℃/ 25 ℃，14 h/10 h 光暗交替培养，植株生长到三叶期时，将其分别置于低温(恒温12 ℃)和适温(恒温25 ℃)的人工气候箱，光照强度为180 μmol /(m2·s)，光照12 h和黑暗12 h，处理7 d后，测定幼苗生长状况和耐冷相关生理指标。低温处理后的突变体cisc(ta)经适温恢复14 d后大田移栽，测定苗期经过低温(12 ℃)胁迫处理和适温(25 ℃)处理的cisc(ta)CK在分蘖期和抽穗期叶绿素含量以及成熟期的农艺性状。

　　1.3 幼苗生长状况调查 低温胁迫后，取10 株幼苗进行株高、单株总根数、最长根长的测量;取100 株幼苗，将根与地上部分开，吸干表面水分后称量根和冠鲜重，然后在恒温烘干箱80 ℃烘干，冷却后称量根和冠干重。

　　1.4 生理性状测定 在苗期，采集12和25 ℃条件下的P1211和突变体cisc(ta)的叶片，放入采样袋，-20 ℃冰箱保存备用。叶绿素含量采用分光光度法测定[16]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[17]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[18]，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法测定[19]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[20]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用淡蓝四唑法测定[21]，游离氨基酸(脯氨酸、亮氨酸等)含量采用酸性茚三酮法测定[22]。

　　2 结果与分析

　　2.1 低温对P1211和突变体cisc(ta)幼苗植株形态的影响 经低温胁迫处理(12 ℃)后，突变体cisc(ta)幼苗地上部分(株高、冠鲜重、冠干重)和地下部分(总根数、最长根长、根鲜重和根干重)各形态指标均显著降低，且各指标的降幅均大于P1211;低温胁迫下，P1211的地上部分和地下部分指标除总根数外，其余指标均有显著降低(表1)。低温胁迫处理对水稻幼苗地上部和地下部生长都产生了不利影响，且对突变体cisc(ta)的影响大于P1211，表明P1211的耐冷性显著强于突变体cisc(ta)。

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