西瓜枯萎病拮抗菌株的筛选与鉴定

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摘要：摘 要：为了从丰富的土壤微生物资源中挖掘对西瓜枯萎病有较高防效的生防菌株，通过梯度稀释和平板涂布法分离獲得西瓜根际土壤主要细菌，采用平板对峙培养和测定盆栽防效的方法，从中筛选出对西瓜枯萎病有较强拮抗活性的菌株，并通过菌落形态观察、生理生化鉴

　　摘 要：为了从丰富的土壤微生物资源中挖掘对西瓜枯萎病有较高防效的生防菌株，通过梯度稀释和平板涂布法分离獲得西瓜根际土壤主要细菌，采用平板对峙培养和测定盆栽防效的方法，从中筛选出对西瓜枯萎病有较强拮抗活性的菌株，并通过菌落形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA和gyrA基因序列比对获得生防菌株的分类地位。结果表明，从8份西瓜根际土壤中分离纯化到182个细菌单菌落，并筛选获得对西瓜枯萎病防效较高的3株拮抗细菌，接种30 d后盆栽防效均高于75%，与30%噁霉灵水剂防效无显著差异。综合形态特征、生理生化特性及序列分析结果，明确拮抗菌株JHXG0406为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。获得了3株对西瓜枯萎病有较好防效的菌株，具有作为生防菌剂开发应用的潜力。

　　关键词：西瓜;枯萎病;拮抗细菌;防治效果;鉴定

　　西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)侵染所引起的、发生在西瓜上的病害，也是世界性范围的病害，一旦发生，很难防治，且随着栽培年限的增加逐年加重[1]。我国是世界上最重要的西瓜生产国和消费国[2]。近年来，随着设施栽培的迅速发展和优势产区的连年种植，连作障碍日益严重，西瓜枯萎病发病率不断升高，对西瓜产量和品质造成了极大的影响，限制了西瓜产业的可持续发展[3-4]。选育应用抗枯萎病的西瓜品种是西瓜枯萎病最安全有效的防控途径，但目前仍未发现对西瓜枯萎病免疫的西瓜种质资源[5-6]。砧木嫁接是生产上防治枯萎病的有效途径，但嫁接栽培后，西瓜品质受到明显影响[7-8]。化学防治对西瓜枯萎病防效低，极易产生抗药性，且造成环境污染和食品安全等问题，导致化学农药在西瓜枯萎病防治上的应用逐渐被弱化[9-10]。

　　以微生态调控为基础的土传病害生物防治具有安全、无污染等优点，在生产中日益受到重视。从根际土壤中分离出大量的拮抗菌株，将其定殖于寄主植物根际，维持根际周围有益微生物菌群数量，可有效干扰病原菌的定殖侵染，是枯萎病等土传病害有效防控的主要途径[11]。关于西瓜枯萎病拮抗菌株的筛选应用已有大量研究报道[11-19]，但由于其生产应用防效不理想，西瓜枯萎病的生物防控还未得到种植者的广泛认可。因此，筛选挖掘西瓜枯萎病有效生防资源，获得拮抗菌株抑制作用的准确评价应用是目前首要解决的关键问题。笔者旨在筛选对西瓜枯萎病病原具有较高防效的生防细菌，为生防菌制剂的开发利用提供充分的菌株资源。通过平板对峙培养和盆栽活体试验从西瓜根际土壤中筛选对西瓜枯萎病具有较强防效的拮抗菌株，并对其进行生理生化特性和分子鉴定，以期为西瓜枯萎病的有效控制提供技术支撑。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　西瓜枯萎病病原菌XGKW01(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)由天津市植物保护研究所种苗病害研究室保存。拮抗菌株来源：从土壤中分离纯化获得182株菌株。西瓜品种为‘京欣一号’，是北京市农林科学院蔬菜研究中心选育的早熟品种。对照药剂为30%噁霉灵水剂，由山东省青岛润生农化有限公司生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 拮抗细菌分离与初筛 2017年4—6月从天津市西青、静海等西瓜种植地采集健康植株根际土壤样品8份，每份样品不少于50 g，将采集的土壤样品保存于天津市植物保护研究所种苗病害研究室，4 ℃冷藏箱中保存备用。

　　土壤根际细菌的分离纯化：将采集的土样放入盛有250 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃ 120 r·min-1摇床震荡1 h使其充分混匀后，静置15 min，取上清液稀释105、106和107倍，每个稀释度取50 μL稀释液在NA平板上涂布，28 ℃恒温培养箱中培养48 h。48 h后挑取形态不同的单菌落，试管纯化待用。

　　采用平板对峙培养法测定土壤中分离的182株菌株对西瓜枯萎病菌的抑制作用。在PDA平板中央接种直径为4 mm的病原靶标菌株XGKW01，分离纯化的细菌划线接种在距XGKW01菌株20 mm的左右2点，每皿接种2个供试细菌，以不接种细菌的XGKW01平板为空白对照。25 ℃恒温培养箱中培养5 d后，采用十字交叉法测量对照靶标病原XGKW01的菌落生长直径及对峙培养平板的菌落直径，并计算抑菌率。采用SPSS 19.0软件邓肯氏新复极差法对不同菌株对XGKW01的抑菌率进行统计分析。

　　抑菌率/%=

　　[对照病原菌菌落直径-病原菌菌落直径对照病原菌菌落直径]×100

　　1.2.2 拮抗细菌对西瓜枯萎病苗期防效测定 将初筛获得的16株对XGKW01抑菌率大于50%的菌株进行苗期盆栽试验。西瓜种子催芽后播种于营养钵(口径7 cm×高7 cm)中，每个营养钵中2株西瓜苗，在2～3片真叶期(2017年10月11日)，选取长势一致的西瓜苗进行盆栽接种试验，试验在天津市农科院武清创新基地植保所设施温室中进行。试验设18个处理，其中1至16号处理为拮抗菌株灌根处理，将各处理西瓜苗采用灌根法接种10 mL浓度为108 cfu·mL-1拮抗菌株菌悬液;17号处理为药剂对照处理，灌根施用10 mL 30%噁霉灵水剂1 000倍液;18号为清水对照处理。每个处理3次重复，每次重复20株幼苗。各处理灌根接种拮抗菌株和化学药剂2 h后，将其分别灌根接种10 mL 106个孢子·mL-1的XGKW01孢子悬浮液。接种 15 d(10月26日)和30 d(11月10日)后调查各处理西瓜病情指数[12]，获得数据采用Excel 2007软件计算防效，利用SPSS 19.0软件采用邓肯氏新复极差法对不同处理间的防效差异进行统计分析。

　　1.2.3 拮抗菌株的鉴定 对筛选获得的西瓜枯萎病拮抗菌株进行形态学观察、生理生化和分子生物学鉴定。将菌株于NA培养基上划线培养，28 ℃恒温培养24 h后，参照《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化测定[13]。提取拮抗菌株的基因组DNA采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根DP302)，采用细菌16s rDNA通用引物(16s-27F/ 16s-1492R)和gyrA基因序列扩增引物(gyrA-f/ gyrA-r)对提取的拮抗菌株DNA进行PCR扩增[14]，扩增获得的产物由苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast比对，并选取相似性较高的菌株，利用MEGA 6.06软件采用邻接法(Neighbour-Joining， NJ， bootstrap 1000)进行序列同源性分析，明确筛选到的拮抗菌株的分类地位。

　　2 结果与分析

　　2.1 拮抗细菌的筛选

　　从西瓜种植地采集的8份未发病的西瓜根际土壤中分离纯化得到182个细菌单菌落，其中从静海地区采集5份土样，分离得到143个细菌菌落;从西青区采集3份土样，分离得到39个细菌菌落。将分离得到的182个菌落分别与西瓜枯萎病病原菌在PDA平板上对峙培养后，筛选到16株菌株，对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑菌率均高于50%，其中菌株JHXG0316的抑菌率最高，为63.98%(表1)。

　　2.2 拮抗细菌对西瓜枯萎病的苗期防效测定

　　在西瓜2～3片真叶期采用苗期盆栽接种试验评价拮抗菌株对西瓜枯萎病的防治效果。由表2可知，接种处理15 d后，清水对照的西瓜苗发病明显，出现叶片萎蔫、枯萎等症状，病情指数达到30.00;而各拮抗菌剂处理的西瓜苗，病情指数为5.00～10.83，明显低于清水对照，其中拮抗菌株JHXG0221处理的防效为83.33%，显著高于其他拮抗菌剂处理，且与对照药剂30%噁霉灵水剂1 000倍液处理无显著差异;拮抗菌剂JHXG0406和XQXG0111处理的防效为80.56%和81.94%，与对照药剂处理无显著差异。接种处理30 d后，清水对照处理的西瓜枯萎病病情指数上升为51.25，其他各处理发病程度缓慢，病情指数扩展为10.42 ～23.75，拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111处理的防效为79.67%、77.24%和77.24%，与对照药剂处理无显著差異。因此，筛选到的拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在使用浓度为108 cfu·mL-1条件下对西瓜枯萎病具有显著的防治效果。

　　2.3 拮抗菌株的鉴定

　　拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在NA培养基上培养24 h后，其单菌落圆形隆起，边缘整齐，乳白色不透明，菌株JHXG0221和XQXG0111菌落边缘有褶皱，JHXG0406菌落边缘相对光滑。由表3可知，3株菌株均为革兰氏阳性菌株，能够水解淀粉和明胶，可以利用精氨酸，可以还原硝酸盐，接触酶反应、V-P试验均为阳性。其中，JHXG0221和XQXG0111菌株不能利用柠檬酸盐和赖氨酸，氧化酶反应为阳性，甲基红反应、吲哚试验为阴性;而菌株JHXG0406能够利用柠檬酸盐和赖氨酸，氧化酶反应为阴性，甲基红反应和吲哚试验为阳性。

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