贝莱斯芽孢杆菌MT310生防机制初探

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摘要：摘 要：为探究贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MT310的生防机制，为该菌田间防病试验提供依据，本文采用平板对峙、二分格平板和指示培养基等3种方法对其抑菌谱、挥发性物质及促生机制进行了检测。结果表明，MT310对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、

　　摘 要：为探究贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MT310的生防机制，为该菌田间防病试验提供依据，本文采用平板对峙、二分格平板和指示培养基等3种方法对其抑菌谱、挥发性物质及促生机制进行了检测。结果表明，MT310对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、黄连根腐病菌(Fusarium sp.)、石榴干腐病菌(Phomopsis sp.)、高粱叶斑病菌(Phyllosticta sorghina)和高粱炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)5种植物病原真菌有明显抑制效果，对烟草赤星病菌抑制效果最佳，抑制率为68.76 %;其产生的挥发性物质(Volatile organic compounds， VOCs)对上述5种植物病原真菌也有抑制效果，对烟草赤星病菌抑制效果最好，抑制率为49.96 %。VOCs对烤烟幼苗的叶长、叶宽、株高和根长有明显的抑制作用，对烟苗根生长抑制效果最明显，相对抑制率为94.44 %。此外，MT310可产生嗜铁素、磷酸酯酶，具有较强的运动能力，可产生复杂的生物膜结构。该结果对菌株MT310合理、安全地运用到大田生产具有一定指导意义。

　　关键词：贝莱斯芽孢杆菌;抑菌效果;挥发性物质

　　貝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MT310是从贵州省遵义市植烟区烤烟根围土壤中分离的有益生防菌株，在2018年田间试验作为生防菌剂施用对烟草黑胫病田间防效高达70.1%[1]，是一株极具应用效果的生防芽孢杆菌。芽孢杆菌生防机制多样，其首要的作用条件是定殖于植物根部或根部环境中，从而发挥生防效用[2-3]。拮抗效果是其抗菌防病的重要机制之一[4-5]，芽孢杆菌能产生的拮抗物质主要包括抗生素、细胞壁降解酶类以及挥发性物质(Volatile organic compounds，VOCs)等，能够直接或间接地作用于病原菌[4]。例如，马冠华[6]研究发现，烟草内生细菌Itb57对烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)等多种植物病原真菌均具有良好的拮抗效果，且还具有促进种子萌发的功效;陈海英等[7]发现多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CP7对多种植物病原细菌具有抑菌活性;郑香香等[8]发现芽孢杆菌的挥发性物质能够显著抑制链格孢菌(Alternaria alternata)菌落生长。因为生防产品作用机理是其应用效果稳定的主要原因[9]。因此，本研究通过MT310抑菌谱检测，挥发性物质作用和生防相关酶类检测等进一步明确其生防机制，为提高MT310田间生防效果以及生防制剂的研发提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 供试菌株

　　烟草赤星病菌(A.alternata)、黄连根腐病菌(Fusarium sp.)、石榴干腐病菌(Phomopsis sp.)、高粱叶斑病菌(Phyllosticta sorghina)和高粱炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)和贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)MT310均由贵州大学农学院植物病理教研室提供。

　　1.1.2 供试烤烟

　　选用贵州烤烟繁育中心生产的K326包衣种。包衣种用无菌水清洗去除外种子外部包衣，75%乙醇溶液灭菌1min，40%NaClO浸泡20min，再用无菌水清洗离心3次，于超净工作台上吹干种子备用。

　　1.1.3 培养基

　　LB固体培养基用于芽孢杆菌培养，LB液体培养基用于生物膜测定;PDA培养基用于植物病原真菌培养及对峙试验;LB半固体培养基(0.8%琼脂)用于芽孢杆菌运动性检测;MS培养基用于烤烟种子培养;磷酸脂酶检测培养基、嗜铁素检测培养基、葡聚糖酶检测培养基[10]用于检测芽孢杆菌是否产生嗜铁素、磷酸酯酶、葡聚糖酶。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抑菌谱测定

　　参考周霄等[11]的对峙试验稍作改动，测定贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)MT310对烟草赤星病菌(A. alternata)、黄连根腐病菌(Fusarium sp.)、石榴干腐病菌(Phomopsis sp.)、高粱叶斑病菌(P. sorghina)和高粱炭疽病菌(C. graminicola)等5種植物病原真菌的拮抗效果。采用十字交叉法[10]测量菌落直径，使用DPS数据处理系统Duncan新复极差法对其抑制率数据进行分析。

　　抑菌率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100

　　1.2.2 挥发性物质抑菌谱检测

　　采用二分格平板法[10]，使用90mm的二分隔培养皿测定MT310挥发性物质对5种病原菌的抑制效果。在第二分隔培养皿一侧加入10mLPDA培养基，用于培养植物病原真菌;另一侧加入10mLLB培养基，用于培养MT310，以一侧不培养MT310，另一侧培养值物病原真菌为对照[8-9]。培养皿外用Parafilm 封口膜封住，隔断皿内外空气的流通。每处理5个重复，密封后于28℃，黑暗条件下倒置培养，7d后观察病原真菌的生长状况。数据收集和处理方法同1.2.1。

　　1.2.3 生防相关酶类及运动性测定

　　接种MT310于LB液体培养基中，于37℃、200r/min黑暗条件下匀速震荡12h，再10000r/min离心4min弃上消度，收集菌体，加入100μL无菌水制备成菌体悬浮液备用;滴加2 μL菌液于磷酸酯酶检测培养基、嗜铁素检测培养基和葡聚糖酶检测培养基中央处，封口膜密封于37℃黑暗条件下培养7d，观察培养基上是否出现消解圈;滴加2μL菌液于LB培养基(0.8%琼脂)中央处，封口膜密封，于黑暗条件下培养12h，观察MT310的运动状况。挑取单菌落接入3mLLB液体培养基于 30℃、180r/min恒温振荡培养12h，菌液离心，弃上清液，菌体按原始体积的1/100 接种到盛有2mLLB液体培养基的12孔板中，平缓移至水平桌面上静置， 室温培养， 每处理3个重复，每12h观察一次生物膜的形成情况。

　　1.2.4 挥发性物质对烤烟幼苗生长的影响

　　试验设2个处理，每处理5个重复;使用90mm直径的二分格培养皿测定芽孢杆菌MT310对烤烟幼苗生长的影响。在二分格两侧均加入MS固态培养基10mL，培养皿一侧培养芽孢杆菌(芽孢杆菌划线长度40mm)，另一侧培养10粒烤烟种子，参照文献[12]对烤烟种子进行培养;以一侧只培养烤烟种子，另一侧不培养芽孢杆菌的处理为对照(CK)。培养皿用Parafilm封口膜密封，于25℃光照12h，20℃条件下暗处理培养15d，测量烟苗的农艺性状，参考 YC/T142-2010《烟草农艺性状调查测量方法》稍作改动后13d侧量。

　　2 结果与分析

　　2.1 菌株MT310抑菌谱测定

　　MT310对烟草赤星病菌(A.alternata)、黄连根腐病菌(Fusarium sp.)、石榴干腐病菌(Phomopsissp.)、高粱叶斑病菌(P. sorghina)和高粱炭疽病菌(C. graminicola)等5种植物病原真菌均具有明显的抑制效果(图1)，抑菌率分别为68.76%、57.57%、44.64%、35.56%和42.25%(表1)。其中，对烟草赤星病菌(A. alternata)的抑制率最高。

　　2.2 挥发性物质抑菌谱检测

　　MT310产生的挥发性物质(VOCs)对烟草赤星病菌(A. alternata)、黄连根腐病菌(Fusarium sp.)、石榴干腐病菌(Phomopsis sp.)、高粱叶斑病菌(P. sorghina)和高粱炭疽病菌(C. graminicola)等5种植物病原真菌均有一定抑制作用(图2)，抑菌率分别为49.96 %、18.79 %、10.32 %、35.93 %和32.94 %(表2)。其中，对烟草赤星病菌(A. alternata)的抑制率最高。

　　2.3 生防机制及运动性

　　菌株MT310在LB培养基(0.8% 琼脂)上培养12h即可长至全皿，还可在72h内形成复杂的生物膜，表明该菌株具有较好的运动与定殖能力。平板检测发现，在嗜铁素和磷酸酯酶检测平板上产生透明圈，表明MT310可产生嗜铁素和磷酸酯酶等生防相关酶;但MT310不能使葡聚糖酶检测培养基出现消解圈，说明其不产生葡聚糖酶(图3。

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