朱砂根种子组织培养与愈伤组织的诱导

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摘要：摘 要：目的：研究药用观赏植物朱砂根种子组织快繁技术和试管苗不同部位愈伤组织诱导，为其转基因、毛状根诱导、有效药用成分研究与朱砂根产业化生产苗木提供依据。方法：选用当年采收，籽粒饱满，没有残缺或畸形，没有病虫害的种子为材料，考察不同基本培养

　　摘 要：目的：研究药用观赏植物朱砂根种子组织快繁技术和试管苗不同部位愈伤组织诱导，为其转基因、毛状根诱导、有效药用成分研究与朱砂根产业化生产苗木提供依据。方法：选用当年采收，籽粒饱满，没有残缺或畸形，没有病虫害的种子为材料，考察不同基本培养基、植物激素对朱砂根种子发芽诱导、继代及愈伤组织诱导。结果：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基配方比较适用于朱砂根种子初代培养;MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基配方比较适用于继代培养。不同外植体中，朱砂根茎段有利于促进愈伤组织形成。

　　关键词：朱砂根;种子;组织培养;愈伤组织

　　朱砂根(Ardisia crenata Sims)，又名大罗伞、富贵籽，是紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)观赏药用植物[1]。在我国，主要零星分布于西藏东南部至台湾，湖北至海南岛等热带与亚热带地区[2]。作为传统药用植物，朱砂根具有祛风除湿、祛痰止咳、降血压、抗癌抑菌、抗HIV和抗肿瘤等重大功效[3]。朱砂根自然繁殖缓慢，扦插和压条繁殖系数相对较低，播种繁殖易产生性状分离，阻碍了朱砂根的产业化开发和利用。植物组织培养在离体条件下获得再生完整植株，生长周期短，繁殖率高，并能保持优良品种的遗传特性，是拯救濒危植物、生产具有经济价值产品、实现工厂化生产的重要技术方式。黄美娟等[4]报道了朱砂根茎段组织培养和快速繁殖的培养条件;丁力等[5]研究了不同植物激素对朱砂根愈伤组织诱导不定芽的影响;陈俊晖等[6]建立了金边朱砂根的组培快繁体系;蔡长福等[7]探讨了朱砂根组织培养防褐化的技术措施。朱砂根组织培养成苗过程比较漫长，获取无菌苗的外植体材料一般为带芽茎段[8-9]，以种子为外植体材料的研究较少。带芽茎段含真菌、细菌较多，消毒不彻底极易污染或在组培过程中极易褐化死亡。朱砂根的种子数量繁多、取材方便、消毒容易、褐化率低，是最理想的外植体材料。本研究以朱砂根当年结实种子为外植体材料，通过不同的消毒方法、不同浓度细胞分裂素、生长素的组合使用，开展朱砂根种子离体培养和诱导愈伤组织形成的研究，初步建立朱砂根种子离体快繁技术和方法，为朱砂根工业化生产苗木、野生资源保护与次生代谢化学成分研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验材料与处理 实验在潍坊学院生物与农业工程学院重点实验室进行。从潍坊广发花卉市场购买朱砂根盆栽(带果实)，采摘当年籽粒饱满、没有病虫害的健壮种子。无菌播种前对种子进行处理，从植株上摘取朱砂根的成熟果实，去掉果皮和果肉，在洗衣粉溶液中浸泡30min，搓洗干净，然后用纱布包住，流水下冲洗5～6h，用無菌水冲洗3遍，置于无菌瓶中用无菌水浸泡24h(每隔12h换水1次)。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 消毒时间试验 将处理好的朱砂根种子置于超净工作台上，先用75%酒精消毒20s，无菌水漂洗3～4次;用0.1%HgCl2(升汞)浸泡4min，无菌水漂洗3～4次，再用0.1%HgCl2(升汞)浸泡2、3、4、5、6min，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干水分后将种子接种到1/2MS培养基上，每瓶接种3粒，共接种10瓶，2次重复。观察种子的萌发情况、褐化情况与污染情况，30d后统计发芽率、褐化率与污染率。

　　1.2.2 种子无菌接种培养基的筛选 以1/2MS培养基为基本培养基，将种子接种到不同激素配方的培养基上(表1)。培养条件：温度(25±1℃)，光照12h/d，光照强度1000lx，光照12h/d。50d后观察试管苗生长情况。

　　1.2.3 朱砂根种子试管苗继代培养基筛选 将生长健壮的种子试管苗剪成1.5～2.0cm长的带芽茎段，接种到继代培养基中，注意形态学上下端不要颠倒，每瓶接种2～3个，继续培养。以MS培养基为基础培养基，附加不同浓度植物激素组合配方(表2)。观察茎段和丛生芽生长情况，30d后统计丛生芽增殖系数。培养条件：温度(25±1℃)，光照12h·d-1，光照强度2000lx，光照12h/d。

　　1.2.4 试管苗不同外植体愈伤组织诱导 以MS+6-BA0.2mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L为基本培养基，接种朱砂根无菌苗的根、茎段和嫩叶，观察愈伤组织的生长情况，30d后统计出愈率和愈伤组织增殖系数。培养条件：温度(25±1℃)，光照12h·d-1，光照强度2000lx，光照12h/d。

　　1.3 数据统计 采用Excel2010和SPSS20.0统计软件对试验数据进行统计分析。

　　启动率(%)=(发芽的种子数/试验种子总数)×100;褐化率(%)=(褐化的种子数/试验种子总数)×100;污染率(%)=(污染的种子数/试验种子总数)×100;出愈率(%)=(出现愈伤组织数/外植体接种数)×100。丛生芽增殖系数=(再生丛生芽数/接种数)×100;愈伤组织增殖系数=(30d时愈伤体积/接种时愈伤体积)×100。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同消毒时间对种子无菌萌发的影响 无菌接种后第2d开始观察不同消毒时间处理后种子的生长情况。由表3可以看出，灭菌时间不同，消毒效果不同，污染率不同。种子接种3～7d后，污染的种子周围培养基开始出现水渍状菌圈，随后种子表面长出霉菌。菌圈颜色加深，表现为黄白色、白色、黑色，黑色居多、菌毛较长，形成较大菌圈，培养基表面形成一层墨绿色菌层。在此期间，若发现接种的种子未全部污染，可将未污染种子及时转移进新培养基中继续观察。种子接种10d后若种子开始长菌污染，主要原因为种子内生菌污染或培养过程污染。

　　消毒时间6min，种子全部污染。延长消毒时间到7min，种子发芽率为36%，污染率最高54%，将时间延长到8、9min，发芽率相同污染率接近，将时间延长至10min，污染率有所下降，种子周围培养基轻微黄色，并且未发芽未污染种子所占比重有所增加。结果表明，灭菌时间过短消毒不彻底，污染率增加，灭菌时间过长则产生毒害作用，降低种子活性，种子褐化死亡，影响发芽。因此选用75%酒精消毒20s，无菌水漂洗3～4次，用0.1%HgCl2消毒总时长达到8～9min，朱砂根种子发芽率为56.7%，污染率36.7%，消毒效果较好。

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