桑叶总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化研究

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摘要：摘要：研究超声波处理时间、乙醇浓度、液料比、水浴温度、水浴时间5个因素对桑叶总黄酮提取率的影响。用响应面优化提取工艺，并研究桑叶总黄酮的抗氧化能力。结果表明：提取桑叶总黄酮最佳工艺，为乙醇浓度80.69%、水浴时间86.13min、水浴温度88.10℃时，提

　　摘要：研究超声波处理时间、乙醇浓度、液料比、水浴温度、水浴时间5个因素对桑叶总黄酮提取率的影响。用响应面优化提取工艺，并研究桑叶总黄酮的抗氧化能力。结果表明：提取桑叶总黄酮最佳工艺，为乙醇浓度80.69%、水浴时间86.13min、水浴温度88.10℃时，提取率最高可达37.58mg/g。该优选提取工艺稳定可行，桑叶总黄酮具有较强的抗氧化活性，为桑叶的开发应用提供了依据，在清除羟自由基时更是达到了86.14%的清除率。

　　关键词：桑叶;总黄酮;超声波辅助提取;抗氧化性
 

　　《东南园艺》(双月)创刊于1973年，是福建省唯一的中级果业期刊。提供果树科研、开发、生产信息，为发展果树行业和促进水果基地建设服务，本刊以南方果树为重点，着重报导热带、亚热带果树科研成果、学术活动、技术。

　　桑树(Morns alba L)属于种子植物门双子叶植物纲蔷薇目桑科桑属，为落叶乔木，桑叶是桑科植物桑的叶，约占桑树地上部产量的64%，每年可摘3～6次。黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一大类化合物，其具有广泛的生理药理活性。黄酮类化合物具有2-苯基色原酮结构，多为结晶性固体，少数为无定型粉末。在桑叶中，黄酮类化合物是其重要的活性成分。本研究利用超声波辅助提取黄酮，以破坏植物细胞壁，加速有效物质的溶解，以提高黄酮提取量。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　试验材料：桑叶采摘于湖北民族学院综合实验楼旁，105℃烘30min，再将温度调至80℃烘干，粉碎过80目筛，备用。

　　试验仪器：GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，AL204电子天平(梅特勒一托利多仪器有限公司上海)，UV-2550紫外可见光分光光度计(尤尼柯仪器有限公司上海)，TDL80-2B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，CR21高速冷冻离心机日本日立公司)，DFY-500粉碎机(江阴市新友机械制造有限公司)，DL-720J超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

　　试验试剂：芦丁(标准品)，乙醇，NaNO3，AI(NO3)，NaOH，聚酰胺树脂，FeSO4·7H2O，H2O2，核黄素，甲硫氨酸，氮蓝四锉，DPPH均为AR。

　　1.2方法

　　1.2.1桑叶总黄酮反应液的吸收光谱。取标准溶液10mL，置于25mL容量瓶中，加30%酒精2.5mL，加入5%NaNO3lmL，混匀，放置6min，加入10%AI(NO3)3lmL，混匀，放置6min，加入lmol/L NaOH 10mL，以30%乙醇定容至25mL，放置15min。以不加标准溶液的相应溶液为空白对照，使用紫外可见分光光度计在200～800nm波长范围进行连续波长扫描。确定最大吸收峰波长为505nm。

　　1.2.2芦丁标准曲线的绘制及桑叶总黄酮的测定。量取0.0，1.0，2.0，……，10.0mL芦丁标准品溶液，分别置于25mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至12.5mL，加入5%NaNO3lmL，混匀，放置6min，加入10%AI(NO3)almL，混匀，放置6min，加入lmol/LNaOH 10mL，以30%乙醇定容至25mL，摇匀后放置15min。在505nm波长下测定吸光度值，芦丁标准曲线为：y=11.05x-0.0107(R2=-0.9976)。桑叶总黄酮含量的测定与标准曲线的方法一致。

　　1.2.3超声波处理对桑叶总黄酮的提取率的试验设计。取5g的桑叶粉末于圆底烧瓶中，按液料比1：20的规格向烧瓶中加入70%乙醇溶液，摇晃混匀，超声波分别处理5、10、15、20、25min，于80℃水浴锅中冷凝回流提取120min，提取物4000r/min离心15min，上清备用。取上清测定计算提取总黄酮提取率。

　　1.2.4不同单因素处理对桑叶总黄酮的提取率的试验设计。设置不同乙醇体积分数(50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%)、液料比(1：20、1：30、1：40、1：50、1：60)、水浴时间(60min、90min、120min、150min、180min)、水浴温度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)对桑叶进行回流处理，定容后提取液4000r/min离心15min，测定提取液中总黄酮含量，计算桑叶中总黄酮的提取率。

　　1.2.5响应面法实验设计方法。在单因素试验的基础上，选择对桑叶黄酮提取率影响最大的3个因素作为响应面优化设计的考察因素。响应面法选用Box-Behnken试验设计，试验的水平与因素设计见表1。

　　1.2.6桑叶总黄酮的纯化方法。首先用90%乙醇多次煮沸聚酰胺，后用去离子水浸泡清洗至澄清。将桑叶黄酮过滤提取液与聚酰胺混合震荡10h，桑叶总黄酮被聚酰胺吸附，用去离子水洗聚酰胺，至滤液无色。再用80.69%乙醇多次洗脱，合并洗脱液，即为纯化后的桑叶总黄酮，并回收处理聚酰胺。

　　1.2.7桑叶总黄酮体外抗氧化活性研究方法。(1)羟自由基清除能力测定。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL浓度为0.02mg/mL桑叶黃酮无水乙醇溶液于带塞试管中，并补加无水乙醇至1.0mL。分别加入浓度为0.2mol/L的pH值7.4磷酸盐缓冲液2.0 mL，充分混匀后加入1.0 mL浓度为1.865mmol/g的FeS04溶液，再次混匀后加入1.0 mL 0.03%H202，于37℃恒温水浴，60min后，在536 nm处分别测量加入桑叶黄酮样品的吸光度。以Vc代替样品作为阳性对照，计算羟自由基清除效率。

　　(2)超氧离子自由基清除能力测定。将3×10-6mol/L的核黄素溶液和0.01mol/L甲硫氨酸溶液在25℃下，20w光照培养箱光照20min，核黄素因光化反应产生超氧离子自由基，再加入氮蓝四唑，使浓度为1×10-4mol/L，于560nm处测量吸光度值A，可表示为超氧离子自由基的浓度。取上述反应体系1mL于带塞试管，滴0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.SmL、1.0mL浓度为0.02mg/mL桑叶黄酮无水乙醇溶液于带塞试管中，并补加无水乙醇至总溶液2.0mL。于560hm处分别测量各组混合溶液的吸光度Al，A-A1即为超氧离子自由基减少的量。以抗坏血酸代替样品作为阳性对照，计算超氧离子自由基清除效率。

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