基于PCR技术的香栓菌和毛栓菌快速检测

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摘要：摘 要：木材腐朽在多数的情况下是由对木材具有腐蚀能力的相关真菌的生长繁殖所造成的。为了鉴定造成木材腐蚀的菌种，本文首先从腐朽的木材上分离获得木材腐朽菌，对其进行培养并进行形态学的初步鉴定，再通过分子生物学领域PCR法对其进行有效性鉴定。分别采

　　摘 要：木材腐朽在多数的情况下是由对木材具有腐蚀能力的相关真菌的生长繁殖所造成的。为了鉴定造成木材腐蚀的菌种，本文首先从腐朽的木材上分离获得木材腐朽菌，对其进行培养并进行形态学的初步鉴定，再通过分子生物学领域PCR法对其进行有效性鉴定。分别采用蜗牛酶法、CTAB法、SDS法和蛋白酶K对木材腐朽真菌的全基因进行提取，且对提取的DNA进行紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测， 然后进行PCR扩增并测序，构建系统发育树，最后对其进行综合的比对分析得知：木材腐朽真菌1为香栓菌， 2为毛栓菌。

　　关键词：木材腐朽菌;分离培养 ;PCR;分子生物学鉴定;形态学鉴定

　　推荐阅读：《内蒙古农业大学学报》(自然科学版)(双月刊)创刊于1957年，是内蒙古高校中创办较早的学报。

　　0 引言

　　木材是我国全部资源中蕴含能量最大的资源品种之一。木材腐朽是木材本身的细胞壁在真菌的作用下逐渐发生分解，进而导致其出现糟烂或者解体，主要是由能够对木材进行入侵腐蚀的真菌的生长代谢造成的[1]。真菌类微生物对木材的侵蚀，会大量的浪费地球上的树木资源，也会导致相关菌类大量繁殖，造成短期内相对环境的微生物群发生改变，进而造成该区域的物种平衡受到严重破坏[1]。本文对木材腐朽菌的基因组进行提取，并进行PCR扩增，将所得序列与Genbank上的全部数据信息开展BLAST比对以及构建系统发育树，并结合形态学观察鉴别出造成木材腐朽的菌种[2-3]。

　　1 材料与实验方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验菌株

　　本实验的菌株子实体从大兴安岭自然保护区柳树的活立木材上采集。用酒精棉将刀具擦拭后进行切割，将采集来的菌株放在无菌袋内保存。

　　1.1.2 培养基

　　本实验主要采用PDA培养基：将马铃薯取200 g去皮处理切片状，煮置的沸液用纱布进行过滤处理，向其中加入20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，用蒸馏水定容至1 000 ml，pH为7.0，121℃灭菌20 min[4-5]。

　　1.1.3 实验仪器

　　实验仪器为仪台式离心机、精密天平、紫外分光光度计、漩涡震荡器、小型高速离心机、组合式摇床、高压蒸汽灭菌锅及PCR仪等。

　　1.1.4 实验试剂

　　实验试剂为山梨醇、SDS、CTAB、醋酸钾、氯仿、蜗牛酶、蛋白酶K、EDTA琼脂糖和TaqDNA聚合酶，这些购自上海绿叶生物科技有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1筛选方法

　　本实验将采集的子实体进行处理，置消毒溶液中处理2～5 min[6-7]。用无菌蒸馏水多次洗涤，用无菌的镊子将组织块取少许转接到PDA培養基上，25 ℃进行培养，当菌体生长出来后进一步分离，置-80 ℃冰箱保藏[8]。

　　1.2.2 培养方法

　　从-80 ℃的冰箱里取出保藏的菌株进行活化处理，首先将其接种到马铃薯固体培养基上，进行活化，培养7 d，再将培养完的菌株转接到PDA平板上。记录每组菌落生长情况，每组实验设置3个平行实验。

　　1.2.3 木材腐朽真菌的分离纯化

　　将培养好的真菌置入液体培养基中进行生长。选择长势比较明显的菌落进行实验，放入25 ℃的摇床中培养。7 d后选择单菌落进行密集划线纯化培养，获得两株纯的木材腐朽真菌，将其进行冰箱4 ℃保藏[9]。

　　由于木材腐朽真菌能够分解纤维素酶，因此将分离获得的纯木材腐朽真菌转接至PDA-愈创木酚培养基中，25 ℃下培养一周，观察菌落生长情况、变色圈是否出现以及菌丝的颜色变化[10-11]。

　　1.2.4 木材腐朽真菌的基本形态观察分析

　　对实验采集的新鲜的木材腐朽真菌子实体及组织等进行宏观环境下观察(图1和图2)。对其生长良好的菌丝进行显微镜观察，在具体的微观环境下进行特征观察(图3和图4)。

　　1.2.5 基因组的提取及DNA纯度分析与对比

　　分别采取蜗牛酶法、CTAB法、SDS法、蛋白酶K法对两种木材腐朽菌进行DNA的提取(4种方法原理过程均为离心洗涤取沉淀物，不一一详细描述)，并选取琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计两种方法对其纯度进行检测。

　　1.2.6 PCR扩增与扩增情况分析

　　提取的DNA用于下列PCR实验：dNTP，缓冲液，Mg2+，模板1 μl，缓冲液2 μl，dNTP 2 ul，Taq酶1 ul，每种引物0.5 μl，补充无菌水至足量。反应的条件：预变性和变性的条件为94 ℃，退火55 ℃，延伸和补平72 ℃，循环次数35次[12-14]，进行PCR产物扩增，对扩增后获得的目的条带再次进行跑胶验证，电泳观察扩增出来的条带长度是否正确。将其回收纯化，将纯化后的产物进行测序。

　　2 结果与分析

　　2.1 形态学鉴定

　　子实体观察：菌1子实体中等，木栓质，无柄。菌盖半圆形，垫状，新鲜时软木栓质，干时坚硬，厚2 cm，白色至浅灰色或浅黄白色无明显的同心环带和轮纹，边缘钝。管口白色或灰色，圆形至近多角形，孢子长椭圆形或短圆柱形，平滑;菌2子实体小，无柄，木栓质。菌盖厚2.5 cm左右，半圆形，平近薄片状，黄白色粗毛束，有同心环带，边缘较薄而锐。菌肉白色，菌管一层，与菌肉同色同质，管孔较大，圆形或广椭圆形，弯曲不整。

　　菌落培养观察：通过对木材腐朽真菌的子实体进行采集和组织块的切取，对其进行消毒处理，利用划线操作法，分离及纯化获得品质较纯的真菌，对其挑取单菌落进行培养，培养两周后，发现两种菌的菌落生长情况比较相似，其表面四周为白色，培养时间越长，菌落的颜色渐变为褐色，菌没有明显味道。生长速度较快，表面呈现绒毛状，疏松的排列在培养基表面，形成一个绒毛状菌落。成熟时为黄褐色。

　　显微镜观察：通过菌落生长完成后挑取少量菌丝进行显微镜检测，在显微镜观察下，菌丝没有任何颜色，出现囊状猪，含有形似卵状的孢子，透明光滑，主要观测的结果如图3和图4所示。细胞壁比较厚重，无明显分生孢子，有很多纤维形状的菌丝状态。

　　经过形态学鉴定，初步判断真菌1属于非褶菌目，多孔菌科，和栓菌属。真菌2属多孔菌目，多孔菌科，担子菌纲。形态学观察无法达到种的鉴定。

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