外生菌根菌对东北红豆杉幼苗生长的影响

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摘要：摘要： 对从红松林下新鲜子实体上分离纯化得到的两株外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3进行ITS序列分析，确定其分别为赭丝膜菌(Cortinarius russus)和美味牛肝菌(Boletus edulis) 。采用打孔注菌法，将两株外生菌根菌分别与东北红豆杉幼苗共同培养，研究其对东北红豆杉

　　摘要： 对从红松林下新鲜子实体上分离纯化得到的两株外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3进行ITS序列分析，确定其分别为赭丝膜菌(Cortinarius russus)和美味牛肝菌(Boletus edulis) 。采用打孔注菌法，将两株外生菌根菌分别与东北红豆杉幼苗共同培养，研究其对东北红豆杉幼苗生长的影响。结果表明：赭丝膜菌与美味牛肝菌均可与红豆杉幼苗形成菌根，菌根侵染率分别为46.7%和35.0%;接种赭丝膜菌与美味牛肝菌后，均能显著提高东北红豆杉幼苗的鲜重、干重、苗高和地径的性状(P<0.05)，其中赭丝膜菌效果优于美味牛肝菌。

　　关键词： 东北红豆杉; 外生菌根菌; 幼苗生长

　　《南京农业大学学报(社科版)》(双月刊)创刊于2001年，是南京农业大学主办、教育部主管的综合性学术理论刊物，在体现学校学科特色的同时，兼顾其他人文学科。

　　外生菌根菌是一类可与宿主植物根系共生形成外生菌根的真菌[ 1 ]。研究表明，外生菌根菌的形成有利于植物对水分和营养物质的吸收，可提高植株根系的适应性和宿主抗性，从而促进苗木生长[ 2 - 3 ]。东北红豆杉(Taxus cuspidata)是东北及华北地区优良的造林、庭院树种，其树皮中含有抗癌活性物质紫杉醇及紫杉烷类化合物[ 4 ]。目前，东北红豆杉可通过播种、扦插等方式进行人工种植，但其幼苗生长缓慢，移栽成活率低。一些研究表明，马勃、丝膜菌及牛肝菌等外生菌根菌对针叶苗木生长、移栽定植存活率均有显著促进作用[ 5 - 10 ]。因此，本试验将从红松林新鲜子实体上分离得到的两株菌根真菌进行鉴定，并研究其对东北红豆杉幼苗苗高、苗木生物量、地茎的苗木生长指标影響，以期为培育优良的东北红豆杉幼苗，提高造林移栽成活率奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1. 1 试验材料

　　供试红豆杉幼苗为1年生东北红豆杉实生苗，引自辽宁省丹东市金沟科技生态园东北红豆杉繁育苗圃。试验用菌株为WSJ-1和WSJ-3，该菌株在辽宁省白石砬子自然保护区红松林下采集的新鲜子实体上分离得到，现保存于辽东学院微生物工程实验室。

　　PDA：马铃薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL。

　　液体培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL。

　　1. 2 试验方法

　　1. 2. 1 菌根菌ITS序列分析

　　将待测菌株WSJ-1和WSJ-3分别接种在PDA平板上，25 ℃培养3天后，用灭菌枪头挑取适量尖端菌丝，置于50μL 菌体裂解液(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)中，80 ℃水浴15 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板。采用通用引物(ITS1： 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG- 3';ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3')扩增ITS序列。扩增体系(50 uL)：1×Taq PCR Master Mix 25μL，DNA模板2 μL(0.1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。扩增产物经电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化、测序拼接。所得序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行在线比对。

　　1. 2. 2 菌根菌液体菌剂的制备

　　将试验菌株在PDA平板上活化后，用直径6 mm的无菌打孔器制备菌饼，在无菌条件下接种至500 mL三角瓶中，置于恒温振荡器上培养4天，培养温度25 ℃，转速120 r/min。制备的液体菌剂冷藏备用，使用前按照祁金玉等方法对菌液进行处理[ 5 ]。

　　1. 2. 3 试验设置

　　选取株高及长势一致的红豆杉1年生实生幼苗180株，地面上平均高度5.2 cm，于当年11月休眠后取出，在营养钵内定植。次年5月，将上述定植于营养钵内的试验材料随机分成9组，每组20株，共设置3个处理，分别为WSJ-1处理组(CR)，WSJ- 3处理组(BE)和对照组(CK)，每个处理3组重复，进行菌根菌侵染试验。

　　试验采用打孔注菌法进行菌根菌接种，即在各试验组幼苗周围均匀打6个孔，孔深约5 cm，每孔加入培养好的菌液20 mL后覆土;对照组做同样处理，加入的样品为无菌PDA液体培养基，然后 所有处理均置于丹东金沟科技生态园温室中培育。接种150天后，用解剖镜观察菌根，统计侵染率 [ 8 ];然后每个处理组随机选取10株样品，测量苗高、地径和鲜重;最后将样本放入60 ℃干燥箱内，烘干24 h后取出测量干重[ 5 ]。试验数据采用SPSS 19.0进行检验分析。

　　2 结果与分析

　　2. 1 外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3的ITS序列分析

　　以外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3的基因组DNA为模板，对其ITS序列进行扩增，获得2条600 bp左右的特异性片段(图1)。测序及序列在线比对结果表明：外生菌根菌WSJ-1与赭丝膜菌(Cortinarius russus)序列相似性为99%;外生菌根菌WSJ-3与美味牛肝菌(Boletus edulis)序列相似性为99%。因此，WSJ-1鉴定为赭丝膜菌;WSJ-3鉴定为美味牛肝菌。

　　2. 2 外生菌根菌侵染情况

　　由不同处理对东北红豆杉幼苗生长的影响(表1)可知：赭丝膜菌(CR)和美味牛肝菌(BE)均可与红豆杉幼苗形成外生菌根。其中，赭丝膜菌处理组的菌根侵染率为46.7%，美味牛肝菌处理组的菌根侵染率为35.0%，对照组无外生菌根形成。

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