不同温度及乙醇含量对生料醋醅中醋酸菌产酸能力的影响

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摘要：摘要：从正常发酵的生料醋醅中分离、筛选得到一株醋酸菌，通过形态学、16S rDNA基因序列分析，确定菌株为巴氏醋杆菌。菌株发酵过程中，改变发酵温度和初始乙醇添加量，研究其对有机酸种类和含量的影响，为评价食醋品质提供参考依据。利用高效液相色谱检测样

　　摘要：从正常发酵的生料醋醅中分离、筛选得到一株醋酸菌，通过形态学、16S rDNA基因序列分析，确定菌株为巴氏醋杆菌。菌株发酵过程中，改变发酵温度和初始乙醇添加量，研究其对有机酸种类和含量的影响，为评价食醋品质提供参考依据。利用高效液相色谱检测样品，检测到的有机酸有草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，最高含量分别是2.5 mg/100 mL，5.0 mg/mL，3.4 mg/100 mL，0.17 mg/mL。在37，42，47 ℃这3个温度下最适宜有机酸生成的乙醇添加量分别是4%，6%，2%，最利于醋酸菌发酵的温度是42 ℃。

　　关键词：生料醋醅;醋酸菌;温度;乙醇含量;有机酸

　　食醋在春秋時期就有记载，是一种常见的酸味调味料，通常以粮食为主料，加入大曲后进行糖化、酒精发酵、醋酸发酵[1]，再加水淋制最终得到成品醋的过程。发酵过程中微生物种类众多、成分丰富，含有多种维生素、氨基酸[2]，还有黄酮、酚酸[3]等有益成分，在降低血压[4]、缓解疲劳[5]等方面有显著效果，因此人们对食醋的需求也越来越高。传统食醋的酿造原料需要经过蒸煮，生料醋的特色就是原料与发酵剂混合后直接发酵[6]，酿造过程中反应类型更多、更复杂[7]，因此口感与传统食醋相比更加醇厚。

　　醋酸菌在酿造过程中扮演重要角色，负责将乙醇氧化成乙酸[8-9]，过高的乙醇含量会抑制微生物的生长[10]，不适的温度会破坏发酵酶类的活性[11]，因此探究合适的初始乙醇含量和发酵温度尤为重要。关于生料醋醅中醋酸菌的研究相对较少，可以参考的数据不多。陈洋[12]从浙江等醋厂中筛选出了耐10%乙醇、耐40 ℃高温的醋酸杆菌，经16S rDNA鉴定为巴氏醋杆菌，并研究了其耐乙醇机制。胡宇豪等人[13]对耐12%乙醇的巴氏醋杆菌的培养基进行了优化，得出在常规培养基中加入5.5%乙醇、0.5%乙酸时，产酸量可以最大程度地提高。李文等人[14]从腐烂的猕猴桃中筛选出一株醋酸菌，耐40 ℃高温、耐12%高醇，经研究可使产酸量提高30.54%。向进乐等人[15]从木瓜醋中检测出了草酸、酒石酸等10种有机酸，且醋酸含量最高。目前，生料醋的研究尚存在较多空白，比如有机酸的类型、高温、高醇对其发酵性能的影响等。

　　试验以自然发酵的生料醋醅为样品，分离纯化出醋酸菌菌种，再通过菌落形态特征、产酸定性试验、16S rDNA序列的分析对其进行鉴定。发酵过程中添加不同含量的乙醇，研究不同温度下对醋酸菌产酸特性的影响，研究成果可以作为优化醋酸发酵的数据参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　1.1.1 培养基

　　基础培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨4 g/L，琼脂12 g/L，1.6%溴甲酚紫4 000 μL，灭菌后加入3%无水乙醇。

　　发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，琼脂12 g/L，接种前加入5%无水乙醇。

　　1.1.2 试剂

　　无水葡萄糖，山东西亚化学工业有限公司提供;硫酸镁，天津市北辰方正试剂厂提供;磷酸二氢钾，北京精求化工厂提供;酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司提供;无水乙醇，天津欧博凯化工有限公司提供;琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司提供;甲醇(色谱纯)、甘油，北京博奥拓达科技有限公司提供。

　　1.2 仪器与设备

　　高效液相色谱仪，安捷伦科技公司产品;超净工作台，苏净安泰AIRTECH产品;AD-88型大容量全温气浴振荡器，常州国宇仪器制造有限公司产品;立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品;MS7-H550-Pro型磁力搅拌器，SCILOGEX产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 醋酸菌的筛选

　　从发酵了12，18，24，30，36 d的醋醅中采样约10 g，再分别加入装有50 mL蒸馏水的锥形瓶中，于28 ℃条件下，以转速180 r/min振荡培养30 min，将样品稀释至10-3，吸取50 μL涂布至基础培养基，于28 ℃恒温培养箱中培养，菌落长出后，多次分离纯化，直至长出单一菌落，最后挑取菌落加入到甘油培养基中，于-20 ℃的冰箱中保存备用。

　　1.3.2 产酸定性试验

　　挑取菌种于发酵培养基活化2次，接入到加有溴甲酚紫酸碱指示剂的基础培养基，于28 ℃条件下培养2～3 d，可使培养基变成黄色的菌株为产酸细菌。

　　1.3.3 菌种鉴定

　　筛选出菌种后编号为1，观察其形态特征并进行分子生物学鉴定，确定其分类地位。

　　1.3.4 醋酸菌的产酸特性试验

　　醋酸菌涂布发酵培养基，于恒温培养箱活化2～ 3 d，挑取已活化的菌株接种到试管发酵培养液，于振荡培养箱培养1～2 d，吸取2%的发酵培养液至锥形瓶培养48 h，从0 h开始，每隔12 h采一次样。乙醇体积分数设置6个梯度，分别是0，2%，4%，6%，8%，10%;培養温度分别为37，42，47 ℃，通过高效液相色谱仪测定产酸类型和产酸量。

　　1.3.5 高效液相色谱条件

　　产酸高效液相色谱检测条件参照杨钰昆等人[16]的测定方法。色谱柱为AQ-C18;流动相为甲醇∶磷酸二氢钾(0.02 mol/L)为3∶97(V/V)，磷酸调pH值至2.7，流速1.00 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。

　　1.3.6 数据处理

　　将通过3次重复试验得到的数据利用SPSS 20软件分析和Excel软件绘制图表。

　　2 结果与分析

　　2.1 醋酸菌的鉴定

　　2.1.1 醋酸菌的分离

　　菌落形态见图1。

　　该菌长势良好，菌落为白色小圆形，表面光滑，边缘整齐。

　　2.1.2 醋酸菌的鉴定

　　(1)形态学鉴定。挑取醋酸菌滴至有无菌水的载玻片上，干燥后用草酸铵结晶紫染液染色60 s，纯净水冲去多余染液，干燥后进行光学显微镜观察。菌体呈短棒状，单个或多个排列。

　　显微镜观察图见图2。

　　(2)分子生物学鉴定。

　　醋酸菌的系统发育树见图3。

　　2.2 37 ℃条件下发酵过程中有机酸的含量变化

　　2.2.1 乳酸含量变化

　　乳酸含量变化见图4。

　　由图4可知，不同乙醇含量的发酵液中，乳酸均呈增加趋势。乳酸含量受乙醇体积分数影响较大，发酵48 h后，乙醇体积分数为8%和10%的培养液中乳酸含量最低，为2.6 mg/mL;添加量为2%时，乳酸含量达到最大，为4.7 mg/mL。

　　2.2.2 乙酸含量变化

　　乙酸含量变化见图5。

　　由图5可知，乙醇体积分数为2%时乙酸含量由0增加到1.8 mg/100 mL;添加8%和10%乙醇时，发酵0 h检测到乙酸含量为0.34 mg/100 mL和-0.36 mg/100 mL，可能是种子培养基代入，12 h后下降到0;添加0，4%，6%乙醇在发酵过程中没有检测到乙酸。

　　2.2.3 柠檬酸含量的变化

　　柠檬酸含量变化见图6。

　　由图6可知，乙醇含量为4%时柠檬酸含量最高，发酵24 h含量最大，为0.08 mg/mL，高于添加量为8%的柠檬酸含量。不同的乙醇添加量对发酵过程中柠檬酸含量的影响各不相同，其中添加量为10%时柠檬酸含量最低，可见高浓度乙醇含量不利于醋酸菌的发酵。

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