中医教育杂志浅析基质细胞衍生因子

来源：核心期刊咨询网时间：2015-05-11 10:5512

摘要：【摘 要】 目的观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)在鸡卵清蛋白(OVA)诱导小鼠哮喘模型中的表达，探索哮喘气道重塑的发生机制。方法40只雌性SPF级C57BL/6小鼠，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法建立OVA小鼠哮喘模型

　　【摘 要】 目的观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)在鸡卵清蛋白(OVA)诱导小鼠哮喘模型中的表达，探索哮喘气道重塑的发生机制。方法40只雌性SPF级C57BL/6小鼠，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法建立OVA小鼠哮喘模型。两组动物于末次雾化结束后24h处死，取肺组织行病理切片，苏木精-伊红染色(HE)观察肺脏的组织病理学变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(immunohistochemistry, IH)技术检测肺组织SDF-1的表达。结果①哮喘组支气管上皮细胞脱落、气道壁增厚，细支气管和血管周围有大量炎细胞浸润;②哮喘组肺组织SDF-1在RT-PCR、Western blot及IH中均为阳性表达，而对照组则否。结论小鼠哮喘时肺组织分泌大量细胞趋化因子SDF-1，可能是哮喘气道重塑的重要因素之一。

　　【关键词】 基质细胞衍生因子 哮喘 气道重塑

　　支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，而气道重塑则是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程。基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)是由基质细胞产生的一种CXC型趋化因子。近年来研究表明，基质细胞衍生因子对组织或器官的创伤、炎症损伤修复起到了重要的作用。但是，SDF-1与哮喘相关性的研究目前还未见报道，我们就此进行了探讨。

　　1材料与方法

　　1.1药品与试剂鸡卵清蛋白(OVA)Ⅴ级(美国GBICO公司);氢氧化铝干粉(郑州派尼化学试剂公司);PBS(美国GBICO公司);SDF-1兔抗小鼠一抗(武汉博士德生物有限公司);过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国DAKO公司);ECL发光液(北京碧云天公司);兔抗小鼠内参β-actin(北京博奥森公司);免疫组织化学试剂盒(美国DAKO公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1哮喘模型的制备小鼠哮喘模型实验参考文献[1]，略有变动。实验动物为40只雌性SPF级C57BL/6小鼠(第四军医大学动物中心提供)，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法[1]构建哮喘模型：0、7、14d于小鼠腹腔内注射致敏液0.2mL/只(致敏液为每0.2mL PBS溶液内含10μg OVA、20μg氢氧化铝)。于第21天开始0.5g/L浓度的OVA生理盐水溶液雾化，每次30min，隔日1次，共计18次。对照组用空白PBS及生理盐水，余同模型组。两组动物于雾化结束后24h处死，取右肺于40g/L甲醛溶液中固定，石蜡包埋，用于病理观察及免疫组织化学(IH)检测;取左肺于液氮中保存，用于RT-PCR及Western-blot测定SDF-1。

　　1.2.2RT-PCR法检测SDF-1的表达提取肺组织总RNA，分光光度仪上定量及检测RNA纯度，用两步法RT-PCR。SDF-1上游引物：5′-CACTTTC-ACTCTCGGTCCAC-3′，下游引物为：5′-CTGAAG-GGCACAGTTTGGAG-3′，序列长度约500bp。PCR反应条件：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。RT-PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在GDS-8000数码成像及分析系统上观察、拍照。

　　1.2.3Western blot法检测SDF-1的表达左上肺组织用液氮粉碎及超声提取总蛋白后，每组取400μL总蛋白，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃ 5min使蛋白变性;经120g/L SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印至PVDF膜;50g/L脱脂奶粉封闭后，SDF-1兔抗小鼠一抗(1∶200)及兔抗小鼠内参β-actin(1∶200)孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2h后，ECL试剂进行检测，在Flourchem FC2成像及分析系统中观察、拍照。

　　1.2.4免疫组织化学法检测SDF-1的表达哮喘组及对照组肺组织蜡块连续石蜡切片，经脱蜡至水后以0.3mL/L过氧化氢溶液浸泡10min，灭活内源性过氧化物酶;抗原热修复后以正常山羊血清封闭，分别加一抗即兔抗小鼠SDF-1抗体1∶200，4℃过夜;加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG 1∶200)，37℃，40min;加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染细胞核，显微镜下观察5～10min，棕黄色染色为阳性信号。

　　1.3统计学分析应用SPSS16.0软件包行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，采用两样本t检验处理统计学数据，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1小鼠的一般情况及肺组织病理学改变哮喘组小鼠经激发后，出现烦躁不安，呼吸急促，腹部翕动，易激惹;对照组小鼠行动敏捷，一般情况未见异常。哮喘组小鼠肺组织切片HE染色可见，小鼠细支气管周围和血管周围有大量的淋巴细胞、单核细胞和多形核细胞浸润，并伴有上皮脱落，气道壁增厚。对照组病理切片无上述表现(图1)。图1小鼠肺组织的病理学改变Fig.1 HE staining of lung histological sections (HE, ×100)A：对照组;B：哮喘组。

　　2.2RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果哮喘组于500bp处出现特异性扩增条带，与预期趋化因子SDF-1扩增片段一致;对照组无特异性扩增条带。正常肺组织几乎无SDF-1 mRNA，哮喘时肺组织有SDF-1 mRNA(图2、表1)。图2RT-PCR法检测两组小鼠肺组织SDF-1mRNA的表达　　Fig.2 The expression of SDF-1mRNA in asthmatic mouse lung tissues on RT-PCRM：蛋白分子量标准;1：哮喘组;2：对照组。表1两组小鼠肺组织SDF-1mRNA的表达

　　2.3Western blot化学荧光法的检测结果哮喘组于15ku处有特异性条带显像，与SDF-1蛋白分子质量一致;对照组无特异性条带显像。正常肺组织无SDF-1蛋白表达，哮喘肺组织表达SDF-1蛋白(图3、表2)。图3Western blot化学荧光检测两组小鼠肺组织SDF-1蛋白的表达情况　Fig.3 The expression of SDF-1 protein in mouse lung tissues on Western blot表2两组小鼠肺组织SDF-1蛋白的表达

　　2.4免疫组织化学(SABC)法的检测结果哮喘组可见支气管上皮细胞破坏，支气管和血管周围有大量炎细胞浸润，支气管壁及周围大量细胞于胞质内出现棕黄色阳性信号;对照组无上述病理变化，无棕黄色阳性信号出现(图4)。图4小鼠肺组织SDF-1表达的IH化学检测Fig.4 Immunohistochemisty staining of lung histological sections (SABC, ×100)A：对照组;B：哮喘组。

　　3讨论

　　SDF-1是由基质细胞产生的CXC型趋化因子，有SDF-1α、SDF-1β，SDF-1γ三个亚型。CXC族细胞因子受体4(CXCR4)是目前所知的SDF-1的唯一受体。SDF-1基因5′末端存在丰富的GC序列，而TATA序列则极少表达。SDF-1在各物种中有高度保守性，在人与鼠的SDF-1的氨基酸序列中有95%是相同的[2]。

　　支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，气道重塑是哮喘难以治疗的主要因素之一。因此，防止或减轻气道重塑也就成为防治哮喘的重要策略，是呼吸领域备受关注的热点问题。我们采用RT-PCR、Western blot方法检测到哮喘肺组织高表达SDF-1。

　　进一步采用免疫组织化学方法，发现SDF-1蛋白质主要分布于支气管壁及周围细胞的胞质内。近年来研究发现，在多种组织损伤修复过程中均有SDF-1的参与。例如，当心[3]、脑[4]、肝脏[5]、肾脏[6]等组织器官损伤时，病灶内SDF-1的分泌量显著增加，促进了纤维组织增生和新生血管形成。在博来霉素诱导的肺间质纤维化小鼠模型中，肺组织高表达SDF-1与肺纤维化有密切关系[7]。气道重塑的本质是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程，因此我们推测：在支气管哮喘导致气道重塑的过程中，肺部损伤释放趋化因子SDF-1可能在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。

　　现有的研究表明，SDF-1与组织损伤的修复有着密切的关联，但其是否在哮喘气道重塑中起到作用，还需要做大量的研究。希望以此为切入点，为治疗支气管哮喘、防止或减轻气道重塑寻找到新的、更为有效的方法。

　　【参考文献】

　　\[1\]TEMELKOVSKI J, HOGAN SP, SHEPHERD DP, et al. An improved murine model of asthma: selective airway inflammation, epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen \[J\]. Thorax, 1998, 53(10):849-856.

　　\[2\]MURDOCH C. CXCR4: chemokine receptor extraordinaire \[J\]. Immunol Rev, 2000, 177:175-184.

　　\[3\]KUCIA M, DAWN B, HUNT G, et al. Cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood after myocardial infarction \[J\]. Circulation Res, 2004, 95(12):1191-1199.

　　\[4\]IMITOLA J, RADDASSI K, PARK KI, et al. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stromal cell-derived factor 1alpha/CXC chemokine receptor 4 pathway \[J\].Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(52):18117-18122.

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