广藿香抑制肠推进药效指纹图谱构建的问题和策略建立

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摘要：广藿香(Herba Pogostemonis)为唇形科植物广藿香Pogostemon cahlin(Blanco)Benth.的干燥地上部分,是常用的芳香化湿药,有芳香化浊、和中止呕、发表解暑之功效[1]。临床上主要用于治疗暑湿所致的胃肠功能失调,如食欲不振、恶心呕吐、泄泻等。现代研究表明,广藿

　　广藿香(Herba Pogostemonis)为唇形科植物广藿香Pogostemon cahlin(Blanco)Benth.的干燥地上部分,是常用的芳香化湿药,有芳香化浊、和中止呕、发表解暑之功效[1]。临床上主要用于治疗暑湿所致的胃肠功能失调,如食欲不振、恶心呕吐、泄泻等。现代研究表明,广藿香调节胃肠的有效成分主要是水溶性成分,通过抑制胃肠运动功能,达到解痉作用;通过增加胃酸分泌、提高胃蛋白酶活性、提高血清淀粉酶活性,消除胃肠道的消化和吸收障碍,从而改善脘腹胀痛、嗳气等消化系统症状,并有镇痛和止泻作用[2]。

　　中药指纹图谱是基于中药成分的多样性和复杂性建立起来的一种质量控制方法。传统的指纹图谱构建方式侧重的是提取尽可能多的成分,并实现有效分离,缺点是与药理效应没有建立必要联系。中药谱效关系学是近几年发展起来的将指纹图谱与药效结合起来考察中药内在质量及其成分与药理活性间关系的新方法[3],是在中医药理论现代研究的基础上,以中药指纹图谱为基础,以效应学为主要内容,应用生物信息学方法,建立中药指纹图谱与中药疗效关系的一门学科[4]。本研究以不同梯度极性溶媒提取广藿香,分别进行药理实验,在最强药理效应的溶媒提取物基础上,构建了其抑制肠推进的HPLC药效指纹图谱,并在构建的广藿香抑制肠推进药效指纹图谱基础上,采用灰色关联法分析了其谱效关系。

　　1 仪器与试药

　　戴安高效液相色谱仪(U3000),广藿香药材购自广州致信中药饮片有限公司、广东天城中药饮片有限公司、广东省药材公司中药饮片厂,经鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.。液相用甲醇、乙腈均为色谱级,磷酸、冰醋酸为市售分析纯。

　　SPF级NIH小鼠18~20 g,雌雄各半,由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号:SCXK粤2006-0015)。

　　2 方法与结果

　　2.1 广藿香抑制肠推进药效指纹图谱的构建

　　2.1.1 最佳提取溶媒筛选

　　2.1.1.1 溶剂极性选择 在文献研究确认广藿香抑制胃肠作用为水溶性成分和溶解性预实验基础上,参照溶剂极性表,选定梯度极性(溶剂)为:4.3(乙酸乙酯)、5.4(丙酮)、6.6(甲醇)和10.2(水)。

　　2.1.1.2 药理实验供试液制备 称取广藿香药材100 g,置蒸馏烧瓶中,加适量水,以水蒸汽蒸馏法蒸馏5 h,趁热以滤布滤过,浓缩,90℃干燥,得干浸膏。以相应溶剂超声溶解,以滤纸滤过,浓缩,干燥,以水溶解(或混悬),即得。

　　2.1.1.3 肠推进实验 NIH小鼠100只,按体重随机分为极性4.3、5.4、6.6、10.2和阴性对照5组,每组各20只,雌雄各半,给药前禁食24 h,但不禁饮。灌胃给药0.1 mL/10 g,剂量在预实验基础上建立,阴性对照组给予等量生理盐水,给药后20 min灌胃给予墨水0.4 mL/只,20 min后脱椎处死,测量胃喷门到墨水最前沿长度。

　　2.1.1.4 实验结果 与阴性对照比较,极性6.6和10.2提取物均表现出抑制肠推进作用,组间比较采用t检验,极性6.6组差异有统计学意义(P < 0.05)。决定选取甲醇提取液为药效指纹图谱用供试液。见表1。

　　表1 广藿香不同极性去油水提取物对小鼠肠推进功能实验结果

　　注:与阴性组比较,*P < 0.05;“-”表示无数据

　　2.1.2 HPLC指纹图谱建立

　　2.1.2.1 色谱条件 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温30℃,流速0.6 mL/min,进样体积20 μL,检测波长333 nm,流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱条件见表2。

　　表2 HPLC指纹图谱梯度洗脱条件

　　2.1.2.2 供试品溶液制备 称取广藿香水提物干浸膏适量,加入甲醇超声使溶解至10 mL容量瓶中,0.45 μm微孔滤膜滤过。

　　2.1.2.3 精密度试验 取供试品,在上述色谱条件下连续进样6次,记录HPLC指纹图谱,采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004年版)计算相似度,均大于0.96,说明精密度良好。

　　2.1.2.4 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在0、4、8、12、16、24 h检测。结果表明,各色谱峰相对保留时间和峰面积比值基本没有变化,RSD < 3%,说明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.1.2.5 重现性试验 平行取样5份,按上述方法,记录HPLC指纹图谱,计算相似度,均大于0.94,说明方法重现性良好。

　　2.1.2.6 供试品溶液测定 取10批供试品溶液各20 μL,分别按上述色谱条件检测,在333 nm下记录0~159 min的色谱图。见图1。

　　图1 10批广藿香水提物HPLC指纹图谱(S1~10为不同批号的样品)

　　2.1.2.7 药效指纹图谱建立与共有峰定性分析 在“2.1.2.6”结果基础上,利用上述软件对指纹图谱进行匹配分析,按照中位数法建立抑制肠推进药效指纹图谱,共有18个特征峰,利用上述软件确定18个共有峰,均以3、10、13~16号峰为主要特征指纹峰。以软件计算相似度,结果表明相似度较高。见图2。

　　2.1.2.8 相似度分析 以夹角余弦法计算相似度,10批样品指纹图谱与对照指纹图谱相比,相似度均大于0.81,分别为0.880、0.881、0.881、0.878、0.910、0.958、0.927、0.927、0.936、0.817,表明采用此方法所建立的药效指纹图谱具有较好的代表性。

　　2.2 谱效关系的灰色关联度分析

　　2.2.1 样品药理效应值测定

　　取健康小鼠110只,雌雄各半,随机分成11组,每组10只。按“2.1.2.2”项下方法制备各样品供试品溶液,按“2.1.1.3”项下方法实验。组间比较采用t检验,结果见表3。

　　表3 10批广藿香水提物对NIH小鼠肠推进的影响(n = 10)

　　注:与空白组比较,*P < 0.05;“-”表示无数据

　　2.2.2 原始数据处理

　　以均值化处理方式将各原始数列转换为均值化数列。

　　2.2.3求绝对差序列

　　以药理效应值列为参考数列(Yo(m)),样品列为比较数列(Yi(m)),按公式计算绝对差数列(△oi(m)),其中△oi(m)=丨Yo(m)-Yi(m)丨。

　　2.2.4 求关联系数

　　关联系数反映2个被比较序列的靠近程度。比较序列(Yi(m))与参考序列(Yo(m))的关联系数按公式计算:Koi=(△min+ρ△max)/(△oi(m)+ρ△max)(分辩系数取ρ=0.2)。

　　2.2.5 求关联度

　　各类关联系数以平均值法求得,表4结果显示,各成分(P)关联度从大到小,顺序为:P14>P13>P5>P12>P10>P8>P11>P9>P16>P18>P1>P6>P2>P17>P15>P7>P4>P3。取0.65为高度关联限定值,P5、P10、P12、P13、P14号峰所对应的化学成分与抑制肠推进作用高度关联。

　　3 讨论

　　3.1 药效指纹图谱构建

　　一个中药往往有多种药理作用,对应可能有多种有效成分群,在建立指纹图谱时,应分别选择对各自有效成分群有最佳溶解能力的溶剂去溶解,从而,每一药理作用都会得到自己的指纹图谱—可称之为药效指纹图谱。该中药所有药理作用的药效指纹图谱共同构成一个指纹图谱群,可称之为该中药的全药效指纹图谱(whole pharmacodynamic fingerprints,WPF)。这可以更好地代表该中药的临床疗效,对解决中药的质量标准与临床疗效之间脱钩的问题有重要意义。可见,药效指纹图谱的构建关键是以药理实验筛选出对相应有效成分群有最佳提取能力的溶媒。

　　已有研究证实广藿香抑制胃肠蠕动主要取决于水溶性成分[2,5-6],故该项药效指纹图谱构建关键是筛选出对水溶性成分中有效成分群有最佳提取能力的溶媒。预实验中,极性3.5以下溶剂几乎没有溶解能力。常见溶剂极性表中,极性6.6以上溶剂,只有6.9(乙二醇)、7.2(二甲基亚砜)和10.2(水),6.9和7.2与6.6的差距太小,故考察的极性确定为4.3(乙酸乙酯)、5.4(丙酮)、6.6(甲醇)和10.2(水)。

　　小鼠肠推进实验的目的在于筛选出所考察溶媒中药理效应最佳者,故未设阳性对照组。结果表明,极性4.3和5.4部分提取物未表现出明显抑制作用,极性6.6(甲醇)提取物药理效应最佳,故确定甲醇为最佳提取溶媒。在此基础上考察了10个不同产地广藿香水溶性成分甲醇提取物抑制小鼠肠推进的作用,与空白组相比,10批广藿香均表现出明显的抑制作用(P < 0.05)。

　　在流动相选择方面,广藿香所含成分复杂,使用单一流动相各色谱峰很难达到理想分离效果。实验中考察了不同组成、不同比例及不同洗脱梯度流动相的分离效果,如不同比例的甲醇-水、乙腈-水,以及往水相适当添加一定比例的磷酸或冰醋酸。研究发现,乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相按所设梯度洗脱时分离效果较好。

　　在检测波长选择方面,考察了254、268、286、320、333、365 nm下的出峰情况,最终选择333 nm作为指纹图谱的检测波长。

　　最终广藿香抑制肠推进药效指纹图谱在去油水溶性成分基础上,以甲醇溶解,以HPLC法构建得到,共含18个特征峰。

　　3.2 谱效分析

　　谱效分析度谱构建指纹图谱谱效分析是近年来研究较多的用于中药质量控制的方法,“谱效结合”是解决中药质量控制基本问题的治本之策[7-8]。谱效关系的阐释依赖于数据分析方法,近年来,多种统计分析方法已得到应用,如相关分析、聚类分析、灰色关联度分析[9-13]、回归分析(普通多元回归、偏最小二乘回归)、主成分分析、图谱比对等。采用这些方法将指纹图谱与药药理效应数据结合建立数学模型,研究二者的相关性,即得到“谱效关系”[4,7,14]。

　　本文采用灰色关联度分析方法研究了所建立的广藿香抑制肠推进药效指纹图谱的谱效关系。分析结果表明,图谱中绝大多数峰所代表的化学成分与抑制肠推进作用有一定的关联,说明广藿香水提物抑制胃肠推进作用是其内在“化学成分群”共同作用的结果。同时,根据关联度越大则对应成分对药理作用贡献程度越大的原则,以关联度大于0.65为标准,特征峰P14、P13、P5、P12和P10分别排前5位,说明所对应的5个化合物在抑制胃肠推进作用中可能起到非常重要的作用,初步揭示了广藿香抑制胃肠蠕动作用的物质基础。（本文图、表略）

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