高选择性过氧化亚硝酰荧光探针的合成及性能研究

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摘要：摘 要 过氧化亚硝酰(ONOO)是生物体系中重要活性氧之一，对其高效检测一直备受关注。本研究以4-二乙基氨基水杨醛和6-甲氧基-1-萘满酮为原料，经一步有机反应，合成了一种带氧鎓正离子的荧光探针PFP，用于检测ONOO。通过紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱系统考

　　摘 要 过氧化亚硝酰(ONOO)是生物体系中重要活性氧之一，对其高效检测一直备受关注。本研究以4-二乙基氨基水杨醛和6-甲氧基-1-萘满酮为原料，经一步有机反应，合成了一种带氧鎓正离子的荧光探针PFP，用于检测ONOO。通过紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱系统考察了探针PFP对ONOO的光学响应。结果表明，此探针具有选择性好、灵敏度高(检出限为15.5 nmol/L)、响应快速(数秒内)、Stokes位移较大(42 nm)、水溶性好等优点。细胞毒性实验表明，探针PFP具有良好的生物相容性，探针浓度为20 μmol/L时，细胞存活率>95%。激光扫描共聚焦显微成像结果表明，此探针可用于活细胞中外源性和内源性ONOO的荧光成像研究。

　　关键词 荧光探针; 活性氧; 过氧化亚硝酰; 细胞成像

　　1 引 言

　　作为细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)之一，过氧化亚硝酰(ONOO)是由一氧化氮(NO)和超氧根自由基(O·2)以1∶1的化学计量比，通过扩散控制的反应方式生成(k = 0.4×1010～1.9 ×1010 L/(mol s))[1]。由于其强氧化性，ONOO具有抗微生物和抗菌活性[2]; 同时，ONOO在细胞信号传导过程中起着重要作用[3]。然而，细胞内过度表达的ONOO可引起生物大分子损伤，如DNA和蛋白质的硝化失活[4～6]; 另外，ONOO还可引起线粒体功能失调。近年的研究表明， ONOO参与多种病理生理过程，如心血管疾病、炎症、癌症、药物引起的肝中毒等[7～10]，因此，ONOO被认为是一种疾病诊断的生物标志物[10]。

　　基于ONOO重要的生理功能，开发可靠有效的ONOO检测手段具有十分重要的意义。目前，由于其高灵敏性、非侵入性成像、高时空分辨率等优点[11～15]，荧光分析法已成为检测生物体系中ONOO的最有效手段[16～18]。自2006年Yang等首次报道高选择性ONOO荧光探针以来[19]，研究者合成了许多不同性能的荧光探针， 用于ONOO的检测及生物成像研究[20～32]。这些探针与ONOO的作用模式主要有：硫属化合物的氧化[20，21]、硼酸或硼酸酯的氧化水解[22，23]、肼的氧化水解[24，25]、活性CC双键的氧化裂解[26，27]和N-氧化去芳基化[28，29]。虽然这些探针对ONOO表现出良好的光学响应，且已在生物体系中得到了较为广泛的应用，但都存在一些问题。例如，硼酸酯或硼酸类探针的水溶性较差并且易受HOCl和H2O2的干扰[18]; 含活性CC双键的探针则易受亲核性物质(如SO23)的影响[33，34]。此外，目前报道的大多数ONOO荧光探针的最大发射波长λmax<600 nm，易受细胞内背景荧光信号干扰，不利于活体成像。因此，开发具有良好水溶性、高选择性及长波发射(λem>600 nm)的荧光探针用于ONOO的生物成像，仍然具有挑战性。

　　自2014年以来，本研究组先后以香豆素-吡啶盐和香豆素-喹啉盐为探针平台，通过活性CC双键的氧化裂解途径，实现了ONOO的荧光检测[35，36]。该系列探针具有良好的水溶性和选择性，但其λmax仅约为490 nm，不利于高信噪比荧光成像。最近，本研究组利用吩噻嗪衍生物构建了一个比率荧光探针，与ONOO作用后，λmax可从630 nm蓝移至480 nm，然而该探针水溶性较差，需要使用表面活性剂Triton X-100作为助溶剂[37]。

　　考虑到上述工作的不足，本研究以水杨醛和萘酮为原料，通过一步缩合反应制备了一种检测ONOO的新型荧光探针PFP。此探针带有一个正电荷，具有极佳的水溶性; 同时，D-A-D电子结构使此探针在628 nm处具有较强荧光。此探针与ONOO反应后得到无荧光的产物，从而实现对ONOO的长波检测。此探针被成功用于活细胞中外源性和内源性ONOO的荧光成像，在ONOO生理功能研究方面具有潜在的应用价值。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　JEOL ECZ600R/S3 600 MHz核磁共振仪(日本Jeol Resonance公司，TMS为内标); Xevo G2-XS QTof质谱仪(美国Waters公司); UV-3900型分光光度计(日本日立公司); FLS 1000型荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器公司); Leica TCS SP8动态超高分辨单双光子激光共聚焦联用系统(德国徕卡公司)。

　　4-二乙基氨基水杨醛(Ark试剂公司); 6-甲氧基-1-萘满酮(安耐吉试剂公司); 5-氨基-3-(4-吗啉基)-1，2，3-恶二唑鎓盐酸盐(3-Morpholinosydnonimine，SIN-1，阿拉丁试剂公司); 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和干扰素(Interferon-γ， IFN-γ)(北京索莱宝科技有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 探针PFP的合成

　　合成路线参照文献[38]并稍作改动。具体合成路线如图1所示，将4-二乙基氨基水杨醛(1.93 g，10 mmol)和6-甲氧基-1-萘滿酮(1.76 g， 10 mmol)溶于20 mL浓H2SO4(98%)，Ar保护下于90℃反应5 h。反应结束后，冷却至室温，然后倒入约200 g冰中。搅拌下缓慢加入HOCl4(70%，10 mL)，将所得沉淀抽滤，并先后用大量水和少量丙酮洗涤滤渣。干燥后，得2.8 g深红色固体PFP，产率为65%。1H NMR (600 MHz， DMSO-d6) δ (ppm)： 8.58 (s， 1H)， 8.30 (s， 1H)， 7.87 (d， J=9.3 Hz， 1H)， 7.39 (d， J=9.1 Hz， 1H)， 7.32 (s， 1H)， 6.88 (s， 1H)， 3.67 (q， J=6.7 Hz， 4H)， 3.40 (s， 3H)， 2.97 (s， 4H)， 1.20 (t， J=6.9 Hz， 6H)。13C NMR(150 MHz， DMSO-d6) δ (ppm)： 163.47， 159.73， 158.62， 155.75， 148.66， 146.44， 132.32， 131.55， 126.34， 120.94， 118.37， 118.18， 118.03， 117.45， 96.37， 45.89， 26.81， 25.06， 16.76， 12.98。TOF MS： calcd. for C22H24NO+2 334.1802， found 334.1811。

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