30种滇西植物β-羟高铁血红素形成抑制活性

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摘要：摘 要： 疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病之一，据世界卫生组织报道每年有数十万人因疟疾而死亡，我国疟疾防治工作虽然取得了长足发展，但在中国云南边境地区和中国西藏林芝地区本地疟疾病例依然存在，再加上西藏自治区和云南省地理位置特殊，与周边疟疾高

　　摘 要： 疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病之一，据世界卫生组织报道每年有数十万人因疟疾而死亡，我国疟疾防治工作虽然取得了长足发展，但在中国云南边境地区和中国西藏林芝地区本地疟疾病例依然存在，再加上西藏自治区和云南省地理位置特殊，与周边疟疾高发的国家接壤，边民来往十分频繁，传染源输入无法杜绝。

　　为了发现植物来源的新型抗疟疾天然产物，该研究依次用75%乙醇和蒸馏水对30种滇西植物进行回流提取，并采用β-羟高铁血红素形成抑制实验对这些样品进行抗疟活性筛选。结果表明：在供试的30种植物中，玉叶金花、回心草以及云南甘草等19种植物粗提物具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性，具有抗疟活性的植物种类涉及17个科、19个属。其中，虾子花、东方紫金牛、姜花水提物以及反瓣老鹳草地下部分醇提物的活性较好，其IC50值分别为796.0、951.0、1 033.0、1 388.9 μg·mL-1，值得进一步深入研究。虾子花、东方紫金牛的HPLC分析结果显示，其活性成分应为酚性成分。

　　关键词： 滇西， 植物， 抗疟活性， β-羟高铁血红素形成抑制实验， HPLC

　　《植物遗传资源学报》(季刊)创刊于1982年，前身是中国农业科学院作物品种资源研究所和中国农学会遗传资源分会主办的《作物品种资源》。

　　瘧疾是一种由疟原虫引起的严重危害人类健康的疾病之一。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界91个疟疾流行国家和地区2016年共有2.16亿疟疾病例，因疟疾死亡人数达44.5万。其中，90%的疟疾病例和91%的死亡病例发生在撒哈拉以南的非洲地区，7%的疟疾病例和6%的死亡病例发生在东南亚地区(World Health Organization， 2017a)。另外，2014年全球疟疾病例为2.1亿例，2015年为2.11亿例，2016年为2.16亿例，明显呈现逐年上升的趋势(World Health Organization， 2017a)。

　　在我国，经过几代人的努力，从建国初期疟疾发病人数高达3 000万例到2016年的3 321例来看，我国疟疾防治工作取得了显著成效(张丽等， 2017)。虽然我国疟疾防治工作取得了长足发展，并且2016年99.9%的疟疾病例为境外输入性病例，但在云南边境地区和西藏林芝地区本地疟疾病例依然存在(张丽等， 2017)。加上中国的西藏自治区和云南省地理位置特殊，与印度、尼泊尔、缅甸和越南等周边疟疾高发的南亚、东南亚国家接壤，边民来往十分频繁，传染源输入无法杜绝。因此，我国疟疾防控形势依然不容乐观。

　　目前，临床用于治疗疟疾的药物主要为奎宁和青蒿素两类(World Health Organization， 2010， 2015)。由于长期使用氯喹和青蒿素，其疟原虫抗药株已逐步显现(Imwong et al.， 2017; Price et al.， 2014; World Health Organization， 2017b)。因此，研发新一代抗疟药物对疟原虫病防治工作意义重大。研究发现，游离血红素对疟原虫有毒性，疟原虫通过将血红素转换成疟原虫色素(β-羟高铁血红素)的方式解毒(Orjih et al.， 1981; Pagola et al.， 2000; Slater et al.， 1991)。与此同时，奎宁等红内期抗疟药可与血红素络合从而抑制β-羟高铁血红素形成，成为红内期抗疟药物的作用靶点之一(Chong & Sullivan Jr， 2003)。因此，本研究采用β-羟高铁血红素形成抑制实验对30种滇西植物进行抗疟活性筛选，并对活性较好的植物样品进行初步的HPLC分析，以期能发现若干种活性较强的植物，为寻找和开发继奎宁、青蒿素之后的第三代植物来源的新型抗疟天然产物奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器

　　试剂：氯高铁血红素、氯喹二磷酸盐、HEPES均购于美国Sigma公司;吡啶、冰醋酸均购于上海申博化工有限公司;乙酸钠购于国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜购于天津化学试剂有限公司;色谱甲醇购于Fisher Chemical公司;HPLC用水为市售娃哈哈矿泉水。

　　仪器：BioTek Synergy HT多功能酶标仪为美国BioTek仪器公司生产;MCO-18AIC CO2培养箱为日本三洋公司生产;AL204电子天平为梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产;EYELA FDU-2100冷冻干燥机为日本东京理化器械株式会社生产;RE-5205旋转蒸发器为上海亚荣生化仪器厂生产;Agilent 1260高效液相色谱仪为美国安捷伦科技有限公司生产。

　　1.2 植物样品

　　30种植物样品(表1)均于2013年采自滇西地区，由大理大学药学与化学学院生药教研室张德全博士鉴定，植物标本均存放于大理大学药学与化学学院姜北教授研究组。

　　1.3 植物提取物的制备

　　取约50 g干燥的植物样品粉碎，依次用75%乙醇、蒸馏水热回流提取。处理过程：(1)用75%乙醇回流提取3次(每次250 mL)，将3次提取的溶液合并后在50 ℃下用旋转蒸发器除去大部分溶剂，之后转移至冷冻干燥机上充分干燥。(2)经75%乙醇提取过的植物残渣继续用蒸馏水回流提取3次，合并提取液蒸馏近干，之后转移至冷冻干燥机上充分干燥。(3)精密称取上述植物提取物浸膏干粉5.0 mg，以1 mL蒸馏水溶解得相应溶液，之后用水按比例(1∶4)稀释成系列浓度溶液备用。植物提取率以冻干粉重量除以提取植物样品干重后乘以100%计算。

　　1.4 β-羟高铁血红素形成抑制实验

　　参照肖朝江等(2014)对30种滇西植物进行β-羟高铁血红素形成抑制活性测试的方法。将50 μL不同浓度的供试样品和50 μL氯高铁血红素储备液(1.0 mmol·mL-1，溶解于DMSO中)混合于96孔板中，一式3份;同时，设置蒸馏水阴性对照和氯喹二磷酸盐阳性对照。之后每孔加入80 μL的醋酸盐缓冲液(4 mol·mL-1，pH 5.0)，置于50 ℃培养箱中孵育5 h;取出待室温后，每孔加入100 μL 30%(v/v)的吡啶-HEPES溶液(20 mmol·mL-1，pH 7.5)使微孔板中固体混悬;室温放置待未反应的羟高铁血红素溶解完全后，从每孔中精密移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后均以200 μL上述吡啶-HEPES溶液稀释，并于405 nm波长处测定吸光值。由羟高铁血红素标准曲线得出未反应的羟高铁血红素的浓度，从而计算出供试品对β-羟高铁血红素形成的抑制浓度(以IC50表示)。

　　1.5 HPLC分析方法

　　色谱柱为phenomenex C18 (250 mm×4.60 mm， 5 μm)，检测波长220 nm，体积流量1 mL·min-1，进样量20 μL，柱温30 ℃。虾子花提取物洗脱程序：水(A)-甲醇(B)：0～40 min，0%～35% B;40～50 min，35%～70% B;50～60 min，70%～100% B;60～70 min，100% B。东方紫金牛提取物洗脱程序：水(A)-甲醇(B)：0～30 min，0%～25% B;30～40 min，25%～50% B;40～50 min，50%～60% B;50～60 min，60%～100% B。

　　2 结果与分析

　　热回流提取实验(表1)表明，30种滇西产植物75%乙醇的平均提取率为21.7%，最高为39.0%(高河菜);水的平均提取率为5.1%，最高为9.2%(拔毒散)。

　　抗疟活性筛选结果(表2)表明，30种滇西植物中虾子花、东方紫金牛、姜花、反瓣老鹳草、拔毒散、高河菜、滇黄芩、土香薷、曲苞芋、接骨木、云南贯众、四翅月见草、西南委陵菜、玉叶金花、木芙蓉、回心草、瑞香狼毒、小苞黄芪和云南甘草19种植物具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性。其中，虾子花、东方紫金牛、姜花水提物以及反瓣老鹳草地下部分醇提物的活性较好，其IC50值分别为796.0、951.0、1 033.0、1 388.9 μg·mL-1。此外，本實验筛选出来的活性植物涉及千屈菜科、紫金牛科、牻牛儿苗科等17个科，虾子花属、老鹳草属等19个属。

　　运用SPSS统计软件(版本19.0)进行两独立样本均数比较的t检验，玉叶金花和回心草水提物以及云南甘草醇提物与阳性对照氯喹二磷酸盐对β-羟高铁血红素形成抑制活性差异具有统计学意义(P < 0.01)。

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